腺病毒介導基質金屬蛋白酶組織抑制劑2基因轉染抑制主動脈細胞外基質降解的實驗研究.pdf

1、該課題主要目的:基質降解是目前主動脈疾病研究的一個新熱點.該實驗旨在構建攜帶抑制血管壁細胞外基質降解的基因——基質金屬蛋白酶組織抑制劑-2(TIMP-2)的復制型缺陷型重組腺病毒載體AdTIMP-2,在體外研究證實其能夠有效轉染主動脈平滑肌細胞(SMC),成功表達TIMP-2蛋白質,并對血管SMC具有抑制增殖、侵襲作用的基礎上,構建大鼠腹主動脈瘤模型,將腺病毒溶液直接灌注到主動脈局部,觀察到腹主動脈瘤形成過程中細胞外基質降解的作用.該課

2、題主要方法:1.攜載TIMP-2基因的腺病毒載體(pAdEasy-1/TIMP-2)的構建;從含有TIMP-2目的基因的質粒pGEM/TIMP-2中純化回收目的基因,繼而再將其定向插入到復制缺陷型腺病毒載體pAdEasy-1,通過酶切鑒定挑選重組正確的克隆.應用電穿孔法轉染感受態(tài)細胞,通過脂質體介導將重組腺病毒轉進HEK293包裝細胞,進一步大量制備重組腺病毒,并純化和測定滴度.同時對其使用的安全性進行評價.2.AdTIMP-2體外轉染

3、主動脈平滑肌細胞及其對靶細胞的作用;分離培養(yǎng)大鼠主動脈SMC,以不同MOI值的AdTIMP-2轉染SMC,應用免疫熒光染色標記被轉染的細胞,測定轉染效率.以逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和Western雜交分別檢測AdTIMP-2轉染SMC后TIMP-2 mRNA的轉錄及TIMP-2蛋白的表達,以酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測細胞培養(yǎng)上清中TIMP-2蛋白的分泌.用MTT法測定AdTIMP-2轉染大鼠主動脈SMC后TIMP-2

4、對細胞增殖能力的影響.采用體外侵襲小室(Boyden Chamber)的方法研究TIMP-2對SMC侵襲能力的影響.應用凝膠酶譜學分析(Zymography)的方法檢測了AdTIMP-2轉染后SMC分泌MMPs的改變.還檢測了目的基因轉染后細胞凋亡程度的改變.3.AdTIMP-2轉染抑制主動脈基質降解的作用;用豬胰腺彈力蛋白酶灌注法建立大鼠腹主動脈瘤模型.于主動脈局部灌注高濃度AdTIMP-2重組腺病毒溶液,注藥后14天測定主動脈直徑改

5、變;組織病理學觀察主動脈炎癥反應和基質降解程度;抗TIMP-2、MMP-2抗體免疫組織化學染色檢測TIMP-2及MMP-2蛋白在主動脈組織中的表達;應用組織原位雜交技術檢測轉染后主動脈組織中的TIMP-2 mRNA及MMP-2 mRNA的表達情況.該課題主要結論如下:1.利用細菌內同源重組的方法能夠高效的構建攜載目的基因的重組腺病毒載體,重復性好,流程相對簡單,所得到的重組腺病毒滴度高、純度好、毒性低.2.我們構建的攜帶TIMP-2基因