大鼠原位-脾蒂內(nèi)構(gòu)建血管化類肝組織治療肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：我國(guó)是肝病大國(guó)，大量的終末期肝病患者需要肝移植治療，但是供體肝嚴(yán)重不足、技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)用昂貴等問(wèn)題限制了其臨床應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)門靜脈或者脾臟直接注射肝細(xì)胞的細(xì)胞移植治療也獲得一定的應(yīng)用，但存在靜脈栓塞以及加重原有的門脈高壓等風(fēng)險(xiǎn)。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，肝組織工程技術(shù)已經(jīng)成為移植研究領(lǐng)域的嶄新前沿。肝組織工程力圖構(gòu)建肝臟細(xì)胞和生物支架材料的三維空間復(fù)合體，以實(shí)現(xiàn)對(duì)肝臟結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。肝組織工程一個(gè)主要技術(shù)障礙是

2、如何構(gòu)建較大尺度的血管化類肝組織。肝臟原位以及脾蒂血管束內(nèi)具有豐富的微動(dòng)靜脈和毛細(xì)血管網(wǎng)(肝血竇)，可以為血管新生及與植入組織的血管溝通創(chuàng)造良好的條件。因此，我們希望在肝臟原位以及脾蒂血管束內(nèi)構(gòu)建較大尺度血管化類肝組織，并探索一種治療肝硬化的新途徑。
　　目的：建立基于凝膠材料的可注射工程化肝組織在肝臟原位及異位(脾蒂血管束內(nèi))植入的新方法，探討在體內(nèi)的構(gòu)建大尺度血管化肝組織工程，以及其改善肝纖維化的作用及機(jī)制。
　　方法：

3、1.將1d齡新生大鼠肝臟取出剪碎，用改進(jìn)的胰酶消化法獲得肝細(xì)胞。常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)，臺(tái)盼藍(lán)染色法評(píng)價(jià)細(xì)胞的活率。2.將新生大鼠肝細(xì)胞分別與纖維蛋白膠、殼聚糖凝膠、鼠尾膠原、透明質(zhì)酸鈉支架材料復(fù)合，形成工程化肝組織凝膠，接種于培養(yǎng)板中，并通過(guò)定期光鏡來(lái)觀察大鼠肝細(xì)胞，四唑鹽(MTT)比色法評(píng)價(jià)細(xì)胞活性。溴甲酚綠法測(cè)上清白蛋白含量，脲酶比色法測(cè)定上清尿素含量。3.用四氯化碳制成實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠模型，肝臟原位多點(diǎn)注射工程化

4、肝組織，3周后測(cè)定血清肝功能并行肝組織學(xué)等檢查。4.2×107新生大鼠肝細(xì)胞與1ml生物蛋白膠混合構(gòu)建工程化肝組織凝膠。切除SD大鼠的脾臟，并遠(yuǎn)端結(jié)扎、近端套圈后形成血管束。將凝膠注入血管束內(nèi)，形成體積≥1cm3的球形組織；同法構(gòu)建肝組織凝膠植入大腿皮下作為對(duì)照。術(shù)后2周行大體觀察，組織切片HE染色。
　　結(jié)果：1.分離得到的新生大鼠肝細(xì)胞數(shù)約為2×107/鼠肝，活性99％以上。收集的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活率均明顯提高。2.4組均可形成三

5、維生長(zhǎng)的工程化類肝樣組織。生物蛋白膠及殼聚糖組的肝細(xì)胞活性及培養(yǎng)上清液中尿素及蛋白含量在第4天達(dá)到高峰，隨后緩慢下降。而在透明質(zhì)酸鈉及鼠尾膠原凝膠中則細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，白蛋白及尿素含量持續(xù)下降。3.大鼠肝硬化模型可見(jiàn)典型肝小葉結(jié)構(gòu)。原位多點(diǎn)注射組大鼠生存率提高，超聲提示肝硬化緩解，肝功能(GOT、GPT、白蛋白、白球比)較單純假手術(shù)組大鼠明顯改善，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織形態(tài)學(xué)顯示：實(shí)驗(yàn)組HE染色、天狼猩紅染色提示纖維化明顯改善，TGF-β免

6、疫組化染色示其表達(dá)顯著降低。4.基于新生大鼠肝細(xì)胞和凝膠材料的工程化肝組織植入體內(nèi)2周后，皮下組殘留組織塊較小，直徑1.63±0.55mm，其內(nèi)血管組織少。實(shí)驗(yàn)組形成了較大的組織塊，直徑7.33±2.4mm，與皮下組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。血管束組的組織塊內(nèi)有大量血管樣結(jié)構(gòu)形成。
　　結(jié)論：1.通過(guò)改良的胰酶冷消化法可以獲取更高細(xì)胞數(shù)量和活率的新生大鼠肝細(xì)胞。2.經(jīng)篩選，4種可注射性凝膠支架材料中生物蛋白膠更適合用于工程化肝組織的構(gòu)建。