片狀工程化肝組織體外構(gòu)建及大鼠原位移植的實驗研究.pdf

1、背景：肝移植是終末期肝病的有效治療手段，但供肝的嚴重缺乏一直制約其發(fā)展，因此解決這一難題必須尋求新的治療技術。肝組織工程是利用肝臟細胞與載體支架復合構(gòu)建可植入的類肝組織，具有緩解器官供體短缺的治療前景。從研究角度，由于肝臟血供豐富，較大尺度類肝組織在大鼠肝臟原位移植手術操作困難，至今缺乏安全有效的方法。本課題擬在體外構(gòu)建較大尺度工程化肝組織并探索在大鼠體內(nèi)原位移植的方法，為開辟一種新的治療途徑奠定實驗基礎。
　　目的：為解決較大尺

2、度類肝組織體內(nèi)移植后難以存活的問題，本項目擬在體外構(gòu)建預血管化的片狀工程化肝組織，并在大鼠肝臟表面制造輕度滲血創(chuàng)面后將植入物貼覆其上，使構(gòu)建物與肝臟盡快建立血液聯(lián)通，以探索將大塊工程化肝組織與原位肝臟整合的新方法。
　　方法：1.種子細胞的制備：胰酶冷消化法獲得新生大鼠肝細胞，肺組織塊貼壁法分離大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞，常規(guī)培養(yǎng)。四唑鹽(MTT)比色法評價細胞的增殖活性，免疫熒光法檢測肝細胞白蛋白表達及內(nèi)皮細胞CD31的表達。

3、　　2.五種片狀支架材料細胞相容性的體外評價：仿血管束支架材料、海綿狀膠原材料、薄膜狀膠原材料、聚乳酸、殼聚糖表觀形貌及掃描電鏡觀察。新生大鼠肝細胞、內(nèi)皮細胞分別與五種材料共培養(yǎng)。運用掃描電鏡觀察細胞/材料黏附情況，MTT比色法檢測細胞增殖情況，白蛋白、尿素氮檢測試劑盒檢測肝細胞功能。3.片狀工程化肝組織體外構(gòu)建兩步法：首先將內(nèi)皮細胞/血管內(nèi)皮生長因子與體積>1cm3的片狀支架材料復合并共培養(yǎng)兩小時；再將肝細胞與預血管化處理的支架材料復

4、合1小時，構(gòu)建成片狀工程化肝組織。4.大鼠的肝表面貼覆移植(n=15)：先將肝臟包膜造成輕微滲血創(chuàng)面，再將構(gòu)建的片狀類肝組織以肝表面貼覆的方法植入，醫(yī)用纖維蛋白膠噴灑固定，4周后取材進行大體觀察及組織切片HE染色、白蛋白及CD31免疫組化染色。
　　結(jié)果：1.分離得到的新生大鼠肝細胞約為1.5×106/鼠肝，活率95％以上，呈團簇生長。MTT值在培養(yǎng)7d升至峰值，隨后逐漸下降。白蛋白染色陽性；分離得到的大鼠肺微血管內(nèi)皮細胞貼壁率約

5、為80％，原代細胞存活率達98％以上。貼壁后呈單層鑲嵌排列鋪路石狀。MTT值在2-4天成倍數(shù)生長。CD31染色陽性。2.五種材料表觀形貌各有不同，種子細胞與支架復合后，電鏡下觀察細胞分布以海綿狀膠原材料最適合細胞黏附。細胞的增殖情況經(jīng)MTT檢測顯示：肝細胞的增殖依次為海綿狀膠原材料>仿血管束支架材料>薄膜狀膠原材料>殼聚糖>聚乳酸；內(nèi)皮細胞的增殖依次為海綿狀膠原材料>仿血管束支架材料>薄膜狀膠原材料>殼聚糖>聚乳酸。肝細胞培養(yǎng)上清中白蛋

6、白和尿素的含量測定表明海綿狀膠原材料結(jié)果最佳；經(jīng)上述實驗篩選后，選擇海綿狀膠原材料作為后續(xù)構(gòu)建工程化肝組織的載體支架。3.體外構(gòu)建的片狀工程化肝組織大小約(1.5×1.5×0.6)cm3，鏡下觀察可見：海綿狀膠原材料上，預培養(yǎng)2小時的血管內(nèi)皮細胞已圍繞膠原細絲貼壁聚集成團，達到了預血管化的目的。大量肝細胞被膠原細絲包繞密集成團，幾乎布滿所有孔隙。4.片狀工程化肝組織通過肝表面貼覆法能夠簡便安全地植入大鼠肝臟原位，并且與受體肝臟完全整合，

7、形成體積>1cm3的新生組織，H.E.染色顯示新生組織內(nèi)肝細胞形態(tài)良好，相互連接成片，內(nèi)皮細胞可在組織內(nèi)部形成大小不等的管腔，內(nèi)有紅細胞分布。免疫組化染色顯示新生組織表達白蛋白，內(nèi)部形成的管腔表達CD31。
　　結(jié)論：1.新生大鼠肝細胞及肺微血管內(nèi)皮細胞分別可以通過胰酶冷消化法及組織塊貼壁法簡便、高效的獲得，在體外培養(yǎng)條件下具有增殖活性且保持原有的分泌功能，可以作為構(gòu)建工程化肝組織的種子細胞應用于肝組織工程研究。2.海綿狀膠原材料