人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:研究人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UC-MSC)和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BM-MSC)的基因表達(dá)差異和免疫調(diào)控能力，然后采用人臍帶間充質(zhì)細(xì)胞治療肝硬化大鼠，研究肝臟在治療前后基因表達(dá)的變化;最后研究肝細(xì)胞表達(dá)的NAT8酶在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療肝硬化過(guò)程中的作用。
　　方法:首先從人臍帶的血管外下層分離培養(yǎng)UC-MSC，然后從人骨髓樣本中分離培養(yǎng)BM-MSC，進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)觀察，以及流式細(xì)胞術(shù)鑒定其細(xì)胞表型，檢測(cè)這兩種細(xì)胞向成骨細(xì)

2、胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化能力，并利用基因芯片檢測(cè)了這2種細(xì)胞的基因表達(dá)差異。其次利用皮下注射四氯化碳方法建立大鼠肝硬化動(dòng)物模型，將人UC-MSC通過(guò)尾靜脈注射途徑對(duì)肝硬化大鼠模型進(jìn)行治療，利用血清學(xué)生化指標(biāo)檢測(cè)和組織學(xué)膠原纖維染色證明UC-MSC的治療效果，最后提取造模前后和治療前后的肝臟RNA，進(jìn)行表達(dá)譜芯片雜交并對(duì)芯片結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)篩選出的NAT8酶進(jìn)行了PCR驗(yàn)證、WB驗(yàn)證和功能分析，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NAT8真核表達(dá)質(zhì)

3、粒和小分子干擾RNA的方法，在L02肝細(xì)胞株中上調(diào)和下調(diào)NAT8的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)雙氧水造成的肝細(xì)胞凋亡的逆轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)果:細(xì)胞表型檢測(cè)和誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)證明，我們從骨髓和臍帶中培養(yǎng)得到的貼壁細(xì)胞表型符合間充質(zhì)細(xì)胞特征，這些細(xì)胞均能夠表達(dá)例如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106和CD166等特征表面分子，同時(shí)不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志如CD14、CD31、CD34和CD45分子。在合適的體外誘導(dǎo)條件下，在體外

4、培養(yǎng)中向造骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，在UC-MSC中上調(diào)的表達(dá)基因主要涉及器官的生長(zhǎng)發(fā)育和細(xì)胞分化，而B(niǎo)M-MSCs中上調(diào)表達(dá)的基因主要包括骨骼發(fā)育和免疫調(diào)控。然后我們利用血清學(xué)檢測(cè)和組織病理學(xué)染色結(jié)果證明，我們利用四氯化碳法成功建立了大鼠肝硬化模型，且UC-MSC治療可以顯著地改善肝損傷。芯片分析結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，UC-MSC治療上調(diào)了補(bǔ)體凝血相關(guān)基因，下調(diào)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和膠原合成等相關(guān)基因。其中NAT8酶在MSC介導(dǎo)的

5、肝細(xì)胞抗損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞株L02實(shí)驗(yàn)中，MSC條件上清可顯著改善雙氧水引起的細(xì)胞凋亡，上調(diào)NAT8酶可以減少雙氧水引起的細(xì)胞凋亡，而下調(diào)NAT8酶則加劇了細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論:UC-MSC增殖快，表達(dá)更多的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，更適合于用于異體間細(xì)胞輸注治療，在UC-MSC治療肝硬化大鼠逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞損傷的過(guò)程中，可能通過(guò)上調(diào)了補(bǔ)體凝血相關(guān)基因，抑制細(xì)胞增殖和膠原沉著發(fā)揮治療作用。其中NAT8酶在MSC介導(dǎo)的肝細(xì)