靶向PD-L1的RNAi慢病毒在胰腺癌Patu8988細(xì)胞中的功能驗(yàn)證.pdf

1、目的:
　　 檢測(cè)胰腺癌標(biāo)本及正常胰腺組織中PD-L1（程序性凋亡因子-1）基因的表達(dá)差異。篩選靶向人PD-L1基因mRNA的RNAi有效干擾序列，并以此序列構(gòu)建靶向PD-L1的RNA干擾慢病毒載體，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系Patu8988，驗(yàn)證其對(duì)PD-L1基因的干擾效率，為進(jìn)一步研究PD-L1在胰腺癌中的作用及機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 實(shí)驗(yàn)共分兩部分：
　　 1．收集22例臨床切除的胰腺癌標(biāo)本

2、，并同時(shí)以22例正常胰腺組織標(biāo)本作對(duì)照，應(yīng)用免疫組化方法(IHC)S-P法檢測(cè)標(biāo)本中PD-L1的蛋白表達(dá)差異情況。
　　 2．根據(jù)PD-L1基因序列篩選出三個(gè)RNA干擾靶點(diǎn)，并以此序列設(shè)計(jì)三條shRNA序列，分別構(gòu)建3個(gè)shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序鑒定三個(gè)質(zhì)粒均構(gòu)建成功。三個(gè)質(zhì)粒分別與過(guò)表達(dá)PD-L1的質(zhì)粒載體一起轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)抑制效果，篩選出最有效干擾序列的質(zhì)粒。以此質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)

3、胞，進(jìn)行病毒包裝成LV-PD-L1-siRNA。滴度測(cè)定后，轉(zhuǎn)染人胰腺癌細(xì)胞系Patu8988，熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，Real-time PCR、ELISA驗(yàn)證PD-L1在mRNA和蛋白水平表達(dá)的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．PD-L1在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于正常胰腺組織(X2=11.023，P＜0.01)。
　　 2．構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體經(jīng)PCR鑒定均可擴(kuò)增出預(yù)期條

4、帶，測(cè)序證明質(zhì)粒構(gòu)建成功。靶向PD-L1基因的shRNA質(zhì)粒對(duì)293T細(xì)胞表達(dá)PD-L1有抑制作用，其中以PD-L1-shRNA-3號(hào)序列的抑制作用最明顯。靶向PD-L1的shRNA片段成功包裝入慢病毒載體，病毒滴度為5×109TU/ml。慢病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)90％以上，其對(duì)人胰腺癌Patu8988細(xì)胞PD-L1在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)的抑制效率分別為72.80%和44.66%，可以用于進(jìn)一步研究實(shí)驗(yàn)。
　　 結(jié)論：