靶向MMP-2的RNAi抑制胰腺癌PANC-1細胞侵襲性的實驗研究.pdf

1、目的：檢測胰腺癌組織中金屬基質蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)的表達及其臨床意義。構建靶向MMP-2基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)真核表達質粒載體，研究RNA干擾(RNA interference，RNAi)對胰腺癌PANC-1細胞MMP-2基因、蛋白表達以及細胞侵襲行為的抑制作用，為將來進一步研究胰腺癌侵襲轉移機制以及抗胰腺癌侵襲治療提供基礎

2、。 方法：利用免疫組織化學方法檢測36例胰腺癌組織和14例正常胰腺組織中MMP-2蛋白的表達情況，比較兩組間的差異，從而分析MMP-2的表達與胰腺癌臨床特征的關系。設計一對針對MMP-2基因的siRNA，并根據該序列合成兩條小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA，shRNA)的DNA模板單鏈，正義模板鏈兩端分別設計加上兩個限制性酶切位點BamH Ⅰ和Hind Ⅲ。退火形成siRNA載體插入片段。用限制性內切酶將siRN

3、A空載體線性化，T4連接酶將插入片段連接到siRNA空質粒中。經PCR和測序的方法鑒定重組質粒是否構建成功。通過陽離子脂質體Lipofectamine TM 2000將重組質粒和陰性對照質粒轉染至人胰腺癌細胞株PANC-1中。以綠色熒光蛋白(GFP)基因為報告基因，用流式細胞儀和熒光顯微鏡觀察質粒轉染效率，G418篩選挑取陽性單克隆細胞培養(yǎng)8周。實時定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chai

4、nReaction，RQ-PCK)檢測MMP-2 mRNA表達變化；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和免疫細胞化學法檢測MMP-2基因在蛋白水平的表達變化：Transwell小室侵襲實驗檢測MMP-2基因被干擾后對PANC-1細胞侵襲能力的影響；MTT比色法檢測PANC-1細胞增殖活性。 結果： (1)36例胰腺癌組織中MMP-2陽性率66.7％，正常胰腺組織中MMP-2陽性率14.3％，兩者差異有統(tǒng)計學意義。MMP-2的陽性表達

5、率與胰腺癌臨床分期有關，但與胰腺癌的分化程度無關。(2)經PCR及測序鑒定證實靶向MMP-2基因的siRNA重組質粒構建成功。(3)經G418篩選挑取陽性單克隆細胞，重組質粒轉染細胞效率最高達82.1％。(4)重組質粒轉染PANC-1細胞后，MMP-2基因mRNA水平被有效地抑制，干擾效率為71.74％；MMP-2蛋白的抑制效率為49.82％。免疫細胞化學染色對照組MMP-2呈強陽性染色，而轉染重組質粒的實驗組MMP-2呈弱陽性染色。(

6、5)Transwell小室侵襲實驗檢測細胞侵襲能力抑制率達33.0‰MTT比色法顯示轉染重組質粒的實驗組與對照組相比，細胞的增殖活性無明顯變化(P＞0.05)。 結論胰腺癌組織MMP-2表達增強，MMP-2的陽性表達率與胰腺癌臨床分期以及淋巴結轉移關系密切，而與胰腺癌的分化程度無關。體外成功構建了靶向MMP-2的siRNA真核表達質粒載體并有效轉染PANC-1細胞。靶向MMP-2的siRNA表達質粒能有效抑制胰腺癌PANC-1細