殺菌通透性增強蛋白BPI23和人酸性成纖維細胞生長因子haFGF融合基因的酵母表達及其活性研究.pdf

1、殺菌/通透性增強蛋白（bacteriacidal/permeability-increasing protein,BPI）是一種分子量為55 KD的陽離子蛋白（簡稱BPI55），具有抑制和殺傷G - 菌，結合、中和內毒素，促進補體活化，增強調理吞噬，抑制炎癥介質生成等功能。重組人BPI N端前199個氨基酸（分子量為23KD的蛋白片段，簡稱BPI23）保留了完整人天然BPI（nBPI55）的全部生物活性。BPI23分子量較小易于光滑型L

2、PS結合，對光滑型大腸桿菌的活性約是完整BPI的30倍。人酸性成纖維細胞生長因子（human acidic Fibroblast Growth Factor ,haFGF）是成纖維細胞生長因子家族成員之一，能夠誘導多種細胞分化、增殖，具有營養(yǎng)和保護神經(jīng)元、促進損傷修復、誘導缺血區(qū)血管形成、促進傷口愈合等功能。創(chuàng)傷愈合是個漫長的過程，在臨床治療過程中仍存在不少障礙，容易受到細菌等感染，引起菌血癥或膿毒血癥，產(chǎn)生全身炎癥反應綜合癥（SIRS

3、），繼之形成多臟器功能障礙綜合癥（MODS）。將BPI功能性N端BPI23基因和haFGF基因通過非極性疏水柔性肽段（Gly4Ser）3的Linker拼接成BPI23-haFGF融合基因，然后克隆到巴氏畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌型表達載體pPICZαA進行表達，并對該基因的表達產(chǎn)物進行生物活性研究，為能開發(fā)出一種既能縮短創(chuàng)傷愈合時間、提高愈合質量又能避免細菌感染的雙功能新型多肽類藥物打下基礎。 研究方法與結

4、果： ①借助Primer Premier 5.0設計2條特異引物，以用Gene SOEing(Gene splicing by overlap extension)技術拼接的帶信號肽的BPI23-haFGF融合基因為模板，PCR擴增獲得到約1.1 kb DNA片斷，克隆至pUCm–T載體序列測定，序列包括編碼無信號肽BPI N端前199個氨基酸基因、編碼（Gly4Ser）3 的Linker基因和不含終止子的 haFGF基因，大小

5、為1107 bp。BLAST結果表明：融合基因前段與Genebank上的BPI mRNA序列（登錄號：4502446) 同源性為99％，融合基因后段與Genebank上的haFGF mRNA序列（登錄號：15055546)完全一致。 ②擴增pUCm -BPI23-haFGF質粒，用Kpn I / Not I切下BPI23-haFGF基因片斷，并定點克隆至經(jīng)相同雙酶切的真核表達載體pPICZαA中，構建pPICZαA-BPI23

6、-haFGF分泌表達載體，測序分析，獲得編碼正確的重組表達載體pPICZαA-BPI23-haFGF。生物信息學軟件分析預測編碼融合蛋白序列，396個氨基酸，分子量43.5 KD，pI 為9.24，具有BPI23和haFGF兩個保守結構域，且BPI23保守區(qū)序列99％同源，haFGF保守區(qū)序列100 ％同源。 ③將SacⅠ線性化的pPICZαA-BPI23-haFGF電轉化至畢赤酵母宿主菌X-33中，Zeocin抗性篩選、PC

7、R鑒定后獲得穩(wěn)定工菌株X-33/pPICZαA-BPI23-haFGF；0.5％甲醇誘導工程菌表達，濃縮上清經(jīng)15％分離膠SDS-PAGE分析和6×His標簽一抗Western Blot鑒定，在約43.5 KD有特異性條帶，與目的融合蛋白預測大小相符，表達量為10～20 μg /ml。 ④優(yōu)化誘導表達條件，探索不同誘導時間、不同溫度、不同甲醇濃度和不同pH進行對表達量的影響，結果發(fā)現(xiàn)：28℃、pH5.0、甲醇終濃度為1.0％、

8、PMSF終濃度為0.5 mM、誘導4d為最佳表達條件，表達量可達約25 μg /ml。經(jīng)HisTrap? HP親和層析純化后，融合蛋白純度高達90％，回收率約為50％。 ⑤生物功能評價： 1.體外實驗：瓊脂孔擴散法表明，融合蛋白具有一定的抑制和殺傷革蘭氏陰性菌的能力；MTT摻入法檢測結果融合蛋白對NIH3T3細胞有促增殖活性，當融合蛋白濃度為0.40mg/ml時，促NIH3T3細胞增殖作用最明顯，當濃度高于或低于0.4

9、0mg/ml時促增殖效果降低。 2.體內實驗：造小鼠皮膚淺二度燙傷模型，隔日涂藥，以aFGF標準品為陽性對照，以0.9％生理鹽水為陰性對照，分別在燙傷后7d、14d、21d 取小鼠受損皮膚作病理切片。結果顯示，燙傷后第14d樣品組創(chuàng)面已基本愈合，潰瘍處毛細血管和成纖維細胞遠比陰性對照組密集，與aFGF標準品作用相當；樣品組比陰性對照組提前2d～3d 愈合。 結論： 本實驗成功構建了分泌型酵母重組表達載體pPIC