芹菜素及其類似物誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的效能研究.pdf

1、目的：
　　比較芹菜素及其結(jié)構(gòu)類似物（如白楊素、香葉木素、黃芩苷元、槲皮素）的成骨效應(yīng),以促進(jìn)骨組織工程構(gòu)建并用于臨床。此外，也為骨折創(chuàng)傷愈合、骨質(zhì)疏松癥相關(guān)治療的新藥開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)于2013年~2015年在暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心細(xì)胞房和暨南大學(xué)骨科疾病研究所完成。從廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買雄性、4周齡SD大鼠。首先，通過全骨髓法提取骨髓原代細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，并利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測定

2、細(xì)胞生長曲線和流式細(xì)胞表面標(biāo)記流式分析。其次，將第3代的MSCs分為以下4組：（1）空白對照組（陰性對照組，含10％FBS的L-DMEM）（2）經(jīng)典成骨誘導(dǎo)組（10%FBS+L-DMEM＋50μg/ml維生素C＋10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉＋10-8mol/L地塞米松）（3）芹菜素組（10%FBS+L-DMEM＋20μM的芹菜素）（4）芹菜素結(jié)構(gòu)類似物（10%FBS+L-DMEM＋20μM白楊素）。測定的指標(biāo)包括：（1）茜素紅染色檢測

3、，確定細(xì)胞外基質(zhì)的礦物化；（2）各組細(xì)胞分別作用7d及14d后，Real-time PCR檢測成骨相關(guān)基因；（3）誘導(dǎo)7d以及14d之后，Western Blot檢測成骨相關(guān)蛋白。對相關(guān)指標(biāo)方差分析比較組間差異，以P<0.05為差異有顯著性意義，P<0.01為差異有非常顯著性意義。
　　結(jié)果：
　　1.經(jīng)過細(xì)胞培養(yǎng)探索，7天、14天后細(xì)胞完全貼壁生長。細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形生長，細(xì)胞生長旺盛，可穩(wěn)定連續(xù)傳代，細(xì)胞形態(tài)及生長速度

4、未見明顯變化。
　　2.BMSCs在接種第一天為細(xì)胞潛伏適應(yīng)期，第二天到第三天生長曲線基本為線性曲線，表明這段時(shí)間是細(xì)胞的對數(shù)生長期。第四天生長曲線變得平緩，第五天又急速生長，第六天后曲線逐漸變得平緩，細(xì)胞增殖明顯減慢甚至出現(xiàn)負(fù)增長的趨勢，生長進(jìn)入平臺(tái)期。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)的第3代大鼠 BMSCs均一表達(dá)CD29，CD44，CD90，陽性率分別為95.65%，87.09%，93.51%；而CD34，CD4

5、5呈陰性，陽性率分別為0.96%，1.19%。
　　4.茜素紅染色結(jié)果顯示，芹菜素和經(jīng)典成骨分別誘導(dǎo)大鼠BMSCs7d，14d后，細(xì)胞聚集樣生長、促進(jìn)細(xì)胞外鈣鹽沉積，在聚集生長的中心可見點(diǎn)狀染色陽性的鈣化結(jié)節(jié)；其中，經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液組鈣化結(jié)節(jié)形成的作用更強(qiáng)，形成的鈣化結(jié)節(jié)不但數(shù)量多，且面積（團(tuán)塊狀）也較前兩者大。
　　5. RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因CollagenⅠ，ALP，Runx2 and OPN mRNA的表達(dá)，總體

6、來講，研究與前面相吻合。即芹菜素能促進(jìn)CollagenⅠ，ALP，Runx2 and OPN mRNA的表達(dá)。
　　6.Western blot檢測成骨相關(guān)蛋白CollagenⅠ，ALP，Runx2和OPN mRNA的表達(dá)。經(jīng)典成骨誘導(dǎo)液、芹菜素、白楊素均能增加成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)。導(dǎo)其中經(jīng)白楊素組誘導(dǎo)的細(xì)胞CollagenⅠ蛋白、OPN蛋白表達(dá)最高，芹菜素次之。經(jīng)成骨誘導(dǎo)劑組誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP、RUNX2蛋白表達(dá)水平最高，芹菜素與白