SAP與PIX在免疫細(xì)胞信號傳導(dǎo)中作用機(jī)制的研究.pdf

1、X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥是一種免疫缺陷的遺傳性疾病。XLP的患者在受EB病毒感染后，出現(xiàn)致死的爆發(fā)性單核細(xì)胞增生。有些患者出現(xiàn)漸進(jìn)性的丙種球蛋白異常和嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞增生異常，如惡性淋巴癌。有些情況下，患者也會出現(xiàn)自身免疫疾病，如脈管炎，腸炎或再生障礙性貧血。甚至在沒有EB病毒的感染下，患者也會出現(xiàn)類似的異常。XLP患者的多種缺陷表明X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥是一種根本性的免疫缺陷疾病。 在1998年，同時有三個實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，

2、SAP/SH2D1A/DSHP這個基因的異常引起了XLP疾病。SAP基因在自然殺傷細(xì)胞(NK)和T細(xì)胞中表達(dá)。人的SAP蛋白是一個由128個氨基酸組成的小分子蛋白，其中氨基端的6-102個氨基酸組成了一個SH2功能域，而羧基端的26個氨基酸與任何已知的功能域都沒有同源性。許多的研究表明，SAP能與SLAM家族的受體結(jié)合，包括SLAM，284(CD244)，CD84，Ly9(CD229)，NTB-A(Ly108)和CRACC。SAP通過其

3、SH2功能域與這些受體胞質(zhì)部分的TxYxxV/I模塊結(jié)合。因此，這些受體可能通過招募SAP傳導(dǎo)下游信號。而在X染色體連鎖的淋巴增生綜合癥患者中缺乏行使正常功能的SAP蛋白，由此人們推斷，XLP患者表現(xiàn)出的免疫缺陷癥狀可能是由于一個或多個SLAM家族受體的信號無法通過SAP傳遞，最終導(dǎo)致了免疫反應(yīng)的嚴(yán)重異常。 在XLP患者中，有多種免疫細(xì)胞出現(xiàn)功能異常，包括CD4陽性T細(xì)胞，CD8陽性T細(xì)胞，NK細(xì)胞和B細(xì)胞。此外，SAP敲除小鼠

4、的免疫缺陷也表明了SAP在免疫調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。這些小鼠極易受嚙齒類淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和伽瑪皰疹病毒-68的感染，其CD8陽性T細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)也存在異常。從SAP敲除小鼠中分離到的CD4陽性T細(xì)胞在CD3抗體刺激下，無法正常分泌白細(xì)胞介素-4(IL-4)，說明其T細(xì)胞表面抗原受體(TCR)介導(dǎo)的信號通路也存在異常。 許多實(shí)驗(yàn)室對SAP在T細(xì)胞和NK細(xì)胞中的信號傳導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了研究。已有報道證明，SAP的SH2功能域能與Sr

5、c家族激酶Fyn的SH3功能域結(jié)合，將Fyn招募到SLAM家族受體上，并由此介導(dǎo)SLAM受體下游的信號通路，最終導(dǎo)致T細(xì)胞活化。然而SLAM缺陷小鼠和Fyn缺陷小鼠表現(xiàn)出的免疫缺陷癥狀不完全相同，提示除Fyn之外，還可能有其它的信號分子參與了SLAM-SAP的信號通路。XLP患者表現(xiàn)出的多種癥狀也支持了這種提示。 通過酵母雙雜交篩選系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)PIX家族成員與SAP結(jié)合。PIX家族是一類小分子鳥苷酸酶Rac/Cdc42的鳥苷轉(zhuǎn)換因子

6、，目前發(fā)現(xiàn)有兩個成員，αPIX和βPIX。PIX蛋白由N端的SH3功能域，DH功能域，PH功能域和C端的一個卷曲螺旋功能域組成。PIX通過SH3功能域與PAK中的脯氨酸富集區(qū)結(jié)合。 通過一系列的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們證明了在T細(xì)胞中，SAP與PIX有直接的相互作用，SAP介導(dǎo)了PIX被招募到SLAM家族受體上，傳導(dǎo)SLAM受體下游的信號。而與SAP類似的另一個僅含SH2功能域的蛋白EAT-2，卻并不能與PIX結(jié)合，也不能將PIX招

7、募到SLAM家族受體上。通過SAP中關(guān)鍵點(diǎn)氨基酸突變，我們發(fā)現(xiàn)PIX和SAP的結(jié)合是通過SAP-SH2功能域中的第二個界面，所以不影響SAP與SLAM的結(jié)合。 通過構(gòu)建截斷體和關(guān)鍵點(diǎn)氨基酸突變，我們發(fā)現(xiàn)，PIX的SH3功能域?qū)τ赟AP的結(jié)合是充分而且必要的。在哺乳動物細(xì)胞中，SAP與PAK競爭結(jié)合PIX。此外，SAP與PIX，活化狀態(tài)的Cdc42形成了復(fù)合體，提示SAP與PIX可能將SLAM家族受體的信號通路與Cdc42介導(dǎo)的下

8、游信號通路相連。 為了揭示PIX與SAP在相關(guān)信號傳導(dǎo)過程中的作用，我們利用已有的報告基因系統(tǒng)檢測了SAP在NFkB，NFAT，AP-1及p53信號通路中的作用。SAP的過量表達(dá)在NFkB，AP-1及p53的信號通路中沒有明顯的作用。而在T細(xì)胞中表達(dá)SAP能顯著激活PMA和離子酶素誘導(dǎo)的NFAT(活化T細(xì)胞核因子)活性。SAP的這個效果是通過與鈣離子信號協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。目前為止，只有活化形式的Ras有如此強(qiáng)的激活作用，提示SAP

9、可能在T細(xì)胞活化中有特殊作用。而SAP的同源類似物EAT-2對NFM、的激活沒有作用。此外，SAP的關(guān)鍵點(diǎn)氨基酸突變體SAP-R32Q和SAP-R78A都沒有這個效果，證明SLAM受體和SAP下游的信號對于SAP的激活作用是必需的。失活狀態(tài)的Ras完全地阻斷了SAP對NFAT的激活，提示Ras的信號通路對SAP激活NFAT是必需的，SAP可能通過直接參與Ras信號通路起作用，也可能通過其它的信號通路影響Ras的信號傳導(dǎo)起作用。

10、為了驗(yàn)證SAP-PIX的結(jié)合對SAP在NFAT的激活作用中是有意義的，我們構(gòu)建了功能性阻斷體PIX-SH3功能域。通過NFAT報告基因檢測，發(fā)現(xiàn)PIX-SH3功能域的表達(dá)完全抑制了SAP對NFAT的激活效果，而表達(dá)不能與SAP結(jié)合的PIX-SH3-W43P/W44G功能域并不影響SAP對NFAT信號的激活，說明SAP-PIX的結(jié)合在T細(xì)胞的活化中可能有特殊作用。此外，F(xiàn)yn-SH3功能域的表達(dá)也不影響SAP對NFAT信號的激活，說明在T