筋膜在針刺信號(hào)傳導(dǎo)中的作用及其與MAPK通路的相關(guān)研究.pdf

1、本研究擬通過(guò)免疫組織化學(xué)和免疫印跡方法等技術(shù)手段觀察針刺后穴位區(qū)和非穴位區(qū)筋膜結(jié)締組織中MAPK信號(hào)通路蛋白的變化，以進(jìn)一步從微觀角度為“筋膜與經(jīng)絡(luò)”相關(guān)的理論提供佐證，并進(jìn)一步解釋筋膜結(jié)締組織支架對(duì)人體生理病理狀態(tài)的調(diào)節(jié)作用。 研究目的: 1、通過(guò)觀察針刺前后筋膜的形態(tài)學(xué)改變，探討針刺作為一種機(jī)械應(yīng)力，在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)而引起生物學(xué)反應(yīng)的最為基礎(chǔ)的反應(yīng)-組織學(xué)形變是如何發(fā)生的。并且探討針刺作為一種傷害性刺激，對(duì)于脊髓的形態(tài)

2、學(xué)有無(wú)影響。 2、通過(guò)免疫組織化學(xué)染色，觀察針刺前后ERK1/2和P38MAPK在針刺局部淺筋膜組織和脊髓的表達(dá)及其在細(xì)胞內(nèi)的定位和移位情況，從針刺局部和脊髓兩個(gè)解剖學(xué)層面和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)角度探討針刺影響機(jī)體的機(jī)理。 3.通過(guò)比較穴位和非穴區(qū)筋膜ERK的表達(dá)情況，從筋膜結(jié)締組織角度探討穴位的特異性；通過(guò)觀察針刺后不同時(shí)間點(diǎn)ERK信號(hào)蛋白表達(dá)的差異，探討針刺后對(duì)于筋膜的最佳取材時(shí)間點(diǎn)，為進(jìn)一步的研究打下基礎(chǔ)。 4.通過(guò)W

3、estern-Blot免疫印記技術(shù)，半定量觀察各組大鼠ERK1/2和P38MAPK在針刺局部淺筋膜組織和肌肉組織的表達(dá)強(qiáng)弱，探討針刺對(duì)局部的筋膜、肌肉的影響差異，以及針刺對(duì)穴位和非穴區(qū)信號(hào)蛋白影響的差異，為“筋膜與經(jīng)絡(luò)”相關(guān)理論提供進(jìn)一步的佐證。 材料與方法: 1、針刺對(duì)局部筋膜結(jié)締組織和脊髓形態(tài)學(xué)的影響。25只SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組5只。空白對(duì)照組不施加任何處理，手針?lè)茄ㄎ唤M在大鼠右側(cè)腹股溝中點(diǎn)處針刺，隔日1次。手

4、針后三里組大鼠針刺入后三里穴后，行針?lè)椒ㄈ缡轴樂(lè)茄ㄎ唤M。電針后三里組大鼠針刺得氣后，連6805AⅡ型電針儀，頻率2HZ。治療10次后取材。各針刺組大鼠分別取以針刺點(diǎn)為圓心，直徑約1.5cm的區(qū)域的淺筋膜約200mg，空白對(duì)照組在非穴針刺點(diǎn)的相應(yīng)位置取材。經(jīng)4%多聚甲醛固定，經(jīng)沖洗、脫水、透明等處理后，分別制作2張石蠟切片用于HE染色。然后各組大鼠經(jīng)4%多聚甲醛灌注，“微型椎板咬骨鉗”取出脊髓組織后制作2張石蠟切片用于HE染色。利用Oly

5、mpus圖像分析系統(tǒng)分析HE染色圖像。 拉伸刺激組大鼠于腰1-2水平脊柱旁開(kāi)2cm處局部備皮，消毒，以針尾為參照物順時(shí)針捻轉(zhuǎn)5周，捻轉(zhuǎn)末用血管夾夾持針柄與皮膚，5min/次，隔日一次，共刺激10d，于末次刺激次日取材，取材后制作鋪片。熒光雙染后利用相差顯微鏡獲取鋪片圖像。 2、免疫組織化學(xué)方法觀察ERK1/2和P38在筋膜和脊髓中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如上（資料與方法1），選取空白對(duì)照組、手針后三里組、電針后三里組，手針?lè)茄ㄎ?/p>

6、組等4組動(dòng)物，處理方法如上，淺筋膜及脊髓取材后，分別制作2張防脫石蠟切片，利用S-P法進(jìn)行免疫組化染色。利用Olympus圖像采集系統(tǒng)采取圖像，并用Imagepro-plus6.0進(jìn)行圖像分析，以平均光密度值（MD，Mean Density）作為比較指標(biāo)，SPSS13.0軟件包對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析。 3、Western-Blot檢測(cè)在ERK1/2在淺筋膜中的含量和與表達(dá)與針刺后時(shí)間關(guān)系。18只SD大鼠，隨機(jī)分為6組，其中對(duì)照組3只

7、，針刺1、2、3、4、5組各3只。針刺各組在大鼠腹股溝區(qū)給予電針治療后，分別在針刺后0h、1h、6h、12h和36h等5個(gè)時(shí)間點(diǎn)取以針刺點(diǎn)為圓心，直徑約1.5cm處的淺筋膜，對(duì)照組也在針刺點(diǎn)相應(yīng)的部位和后三里穴區(qū)取材。取材后利用凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒分別對(duì)組織進(jìn)行提取和定量，Western-blot檢測(cè)各組的ERK1/2及p-ERK1/2的表達(dá)情況，利用ECL發(fā)光試劑盒顯色，Kodak Image Stati

8、on2000 MM成像系統(tǒng)采集圖像，采用圖像處理軟件Image Tool3.0測(cè)定并分析條帶灰度值以檢測(cè)ERK的表達(dá)水平，利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包比較各個(gè)針刺時(shí)間點(diǎn)以及非穴和后三里穴區(qū)的ERK表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)方法分別采用One-Way ANOVA方差分析和兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。 4、Western-Blot觀察ERK1/2和P38在筋膜和脊髓中的表達(dá)含量。材料：凱基全蛋白提取試劑盒、凱基BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒兔多抗ERK1/2

9、、鼠單抗p-ERK一抗、兔多抗P38、β-actin、PVDF膜以及免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠的抗體；SABC（兔抗IgG）-AP試劑盒和SABC（小鼠IgG）-AP試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，組織勻漿器（德國(guó)FLUKO公司，超細(xì)勻漿器），BIO-RAD半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組同材料與方法1?？瞻讓?duì)照組、手針后三里組、電針后三里

10、組，手針?lè)茄ㄎ唤M等4組動(dòng)物處理后，取針刺點(diǎn)局部筋膜和肌肉，經(jīng)蛋白提取和定量后，用Western-blot檢測(cè)各組的ERK1/2、p-ERK1/2及P38的表達(dá)情況，利用SPSS軟件包對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)方法采用One-Way ANOVA方差分析對(duì)各組間ERK1/2、p-ERK1/2和P38的表達(dá)情況進(jìn)行分析。 結(jié)果: 1、針刺后淺筋膜中纖維排列較對(duì)照組更為規(guī)則；組織細(xì)胞核形態(tài)發(fā)生改變，由原來(lái)的圓形或橢圓形變?yōu)楸馑?/p>

11、形或長(zhǎng)條狀，而電針后淺筋膜中纖維排列順序和細(xì)胞核形態(tài)改變并不典型，熒光雙染發(fā)現(xiàn)牽拉引起胞外基質(zhì)變形、纖維緊張并與拉力方向平行排列，細(xì)胞骨架重構(gòu)成“扁梭形”、胞漿縱軸長(zhǎng)而致密、細(xì)胞突起界限不清，胞核小、呈長(zhǎng)梭形，對(duì)照組大量細(xì)胞雜亂無(wú)序填充在纖維網(wǎng)格內(nèi)、單位面積內(nèi)細(xì)胞密度較小、細(xì)胞分界清晰，胞內(nèi)骨架伸展成“片狀”、多突起并相互形成聯(lián)系，胞核近似圓形位于胞漿中心。針刺前后脊髓未見(jiàn)明顯形態(tài)學(xué)改變。 2、光鏡下觀察，大鼠脊髓背角ERK1/

12、2免疫組化反應(yīng)顯色呈棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞分布于脊髓灰質(zhì)神經(jīng)元集中的部位，針刺后深染部位向胞核集中。在淺筋膜中，ERK1/2和P38陽(yáng)性染色區(qū)域多集中在成纖維細(xì)胞或巨噬細(xì)胞核周圍，P38染色較ERK1/2淡，空白對(duì)照組染色較弱，其他各組針刺后有一定程度增加，但以手針?lè)茄ㄎ唤M增加明顯。對(duì)各組MD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯示，處理各組治療后淺筋膜的ERK1/2和P38與對(duì)照組相比均有一定增加（P<0.05），均以手針?lè)茄ㄎ唤M增加顯著。但脊髓的ERK1/2和P

13、38變化情況與筋膜并不完全一致，手針后三里組和手針?lè)茄ㄎ唤MERK1/2在大鼠脊髓中的表達(dá)針刺后有減弱趨勢(shì)。 3、非穴與后三里穴淺筋膜層的ERK和磷酸化ERK的表達(dá)情況均未見(jiàn)明顯差異（均P>0.0）。針刺后各組針刺側(cè)的ERK1/2的表達(dá)均顯著高于自身對(duì)照側(cè)（均P>0.05）。針刺后0h、1h、6h、12 h ERK1的表達(dá)水平逐漸增高，12 h達(dá)最高，36 h在逐漸回落，但針刺后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ERK2以及針刺對(duì)照側(cè)的ERK1/2表達(dá)并

14、不完全按這個(gè)趨勢(shì)，約在針刺后6h達(dá)到高峰。 4、各組針刺后ERK1/2、P-ERK1/2和P38的表達(dá)都有明顯提高，且各組間蛋白表達(dá)均有顯著性差異（P<0.05）。One-way ANOVA分析顯示，與對(duì)照組相比，ERK1/2、p-ERK1/2與P38在筋膜和肌肉中的表達(dá)以針刺非穴組增加最為顯著（均P<0.05），其次是電針后三里組和針刺后三里組。 結(jié)論: 1、牽拉引起筋膜結(jié)締組織胞外基質(zhì)變形、纖維緊張并與拉力方

15、向平行排列，針刺使胞核由原來(lái)的圓形或橢圓形變?yōu)楸馑笮位蜷L(zhǎng)條狀，而電針后淺筋膜中纖維排列順序和細(xì)胞核形態(tài)改變并不典型，提示針刺作為一種機(jī)械應(yīng)力主要通過(guò)捻轉(zhuǎn)、提插等手法使局部的結(jié)締組織纏繞針體進(jìn)而發(fā)生組織學(xué)形變的?；隗w外培養(yǎng)的細(xì)胞的證據(jù)，這些形態(tài)學(xué)改變很大程度上伴隨著重要的細(xì)胞信號(hào)的修復(fù)，基因表達(dá)和基質(zhì)黏附，所以，這些組織學(xué)變化為幫助我們進(jìn)一步理解各種各樣的機(jī)械療法（物理治療，推拿和針灸等）的治療機(jī)理提供了一把鑰匙。 2、免疫組化

16、結(jié)果說(shuō)明：針刺無(wú)論是對(duì)于非穴和穴位局部筋膜中的ERK1/2和P38表達(dá)均有上調(diào)作用，且以手針?lè)茄ㄎ唤M增加明顯，這可能因?yàn)榉茄ㄡ槾厅c(diǎn)皮下筋膜結(jié)締組織非常豐富，針刺入皮下捻轉(zhuǎn)，能夠帶動(dòng)較大范圍的結(jié)締組織，產(chǎn)生很強(qiáng)的沉緊感，而后三里穴區(qū)皮下筋膜相對(duì)較少，捻轉(zhuǎn)針體只能帶動(dòng)較少的結(jié)締組織。陽(yáng)性染色區(qū)域在脊髓中的移位，說(shuō)明針刺對(duì)這種信號(hào)蛋白的活化作用。但ERK1/2和P38在脊髓中的表達(dá)與在筋膜中并不完全一致，從一個(gè)側(cè)面證實(shí)針灸對(duì)人體的影響除了神經(jīng)

17、-體液等調(diào)節(jié)以外，筋膜結(jié)締組織支架的存在可能構(gòu)成另外一個(gè)較為原始的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。 3、在正常的疏松結(jié)締組織中，ERK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白一直有非磷酸化和磷酸化的表達(dá)，而這種表達(dá)又與細(xì)胞的增值和分化有關(guān)。這表明從發(fā)育生物學(xué)角度由中胚層發(fā)育來(lái)的非常古老的疏松結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，在生命個(gè)體的新陳代謝中，一直發(fā)揮著活躍的、積極的作用。而從細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度，穴區(qū)的淺筋膜與非穴區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)有明顯的差別。 4、免疫印跡結(jié)果利用信號(hào)蛋白半定量的手段進(jìn)