新生豬Sertoli細(xì)胞在胰島移植中的免疫保護(hù)作用及其免疫豁免機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：新生豬Sertoli細(xì)胞在Wistar大鼠腎包膜下存活的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：在不使用任何免疫抑制劑和不進(jìn)行任何免疫保護(hù)干預(yù)的措施下，探討新生豬Sertoli細(xì)胞（NPSCs）在Wistar大鼠腎包膜下的生存狀態(tài)并初步研究其自身免疫豁免機(jī)制，為NPSCs與胰島細(xì)胞共同移植的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：體外分離培養(yǎng)10～15日齡的湖北白豬睪丸Sertoli細(xì)胞即NPSCs；該

2、細(xì)胞體外培養(yǎng)3天后，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Sox9和FasL的表達(dá)；同時(shí)將1.5×106個(gè)NPSCs移植入正常Wistar大鼠左腎包膜下，術(shù)后分別在第3、7、14、21和40天切取Wistar大鼠左側(cè)腎臟，采用RT-PCR和免疫組化染色檢測(cè)腎包膜下移植的NPSCs特異性標(biāo)記Sox9的表達(dá)。
　　 結(jié)果：每個(gè)新生豬睪丸可以獲得5.68±1.75×107個(gè)NPSCs，占培養(yǎng)細(xì)胞總數(shù)的90%左右，活性達(dá)95%；體外分離培養(yǎng)的NPSCs能

3、夠穩(wěn)定表達(dá)其特異性標(biāo)記因子Sox9，但FasL 幾乎不表達(dá)。1.5×106個(gè)NPSCs 移植入Wistar 大鼠左腎包膜下第3、7、14和21天后，RT-PCR 證實(shí)腎包膜下的移植物內(nèi)有大量豬Sox9表達(dá)，Sox9免疫組化染色亦表明腎包膜下有成團(tuán)聚集的Sox9陽(yáng)性細(xì)胞；但是移植后第40天時(shí)，RT-PCR 證實(shí)腎包膜下移植物內(nèi)的豬Sox9表達(dá)明顯減弱，同時(shí)免疫組化表明成團(tuán)聚集的Sox9 陽(yáng)性細(xì)胞團(tuán)明顯減少，NPSCs 僅散在存在。

4、　　 結(jié)論：在不使用任何免疫抑制劑和不進(jìn)行任何免疫保護(hù)干預(yù)的措施下，NPSCs在Wistar大鼠腎包膜下可以存活21天以上，但移植后40天時(shí)存活的NPSCs數(shù)量明顯減少，其免疫豁免機(jī)制與FasL的作用無(wú)關(guān)。
　　 第二部分：SD大鼠胰島分離純化及Wistar大鼠化學(xué)性糖尿病模型的建立
　　 目的：優(yōu)化Shapiro的胰島細(xì)胞分離方法，分離純化Sprague Dawley（SD）大鼠胰島細(xì)胞；建立Wistar大鼠化學(xué)性糖

5、尿病模型，為胰島細(xì)胞移植研究奠定技術(shù)支持。
　　 方法：采用含7.5mmol/LCa2+的1mg/ml的V型膠原酶胰管逆行灌注胰腺、37℃靜止消化，F(xiàn)icoll 400不連續(xù)密度梯度離心純化的方法，分離培養(yǎng)SD大鼠胰島細(xì)胞；培養(yǎng)的胰島細(xì)胞經(jīng)雙硫腙（dithizon，DTZ）染色鑒定，ELISA葡萄糖刺激實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分離培養(yǎng)的胰島細(xì)胞功能；200mg/kg的四氧嘧啶一次性腹腔注射誘導(dǎo)Wistar大鼠化學(xué)性糖尿病模型，連續(xù)兩次非空腹血糖

6、≥22mmol/L視為造模成功。
　　 結(jié)果：每只大鼠可獲得520±30個(gè)胰島當(dāng)量（islets equivalent quantity，IEQ）的胰島細(xì)胞，DTZ 染色鑒定后見胰島細(xì)胞純度達(dá)80%，手檢后純度達(dá)90%以上；Wistar大鼠腹腔注射四氧嘧啶后，第3和7天非空腹血糖均大于22mmol/L，并且出現(xiàn)多飲、多尿、體重下降等糖尿病癥狀，造模成功率達(dá)85%。
　　 結(jié)論：經(jīng)優(yōu)化后的分離方法更加簡(jiǎn)捷并獲得了純度較高、

7、大量的大鼠胰島細(xì)胞；通過(guò)單次腹腔注射四氧嘧啶能夠穩(wěn)定、高效的誘導(dǎo)大鼠化學(xué)性糖尿病模型。
　　 第三部分：聯(lián)合移植異種新生豬Sertoli細(xì)胞延長(zhǎng)大鼠同種異體胰島移植存活
　　 目的：探討異種NPSCs在大鼠同種異體胰島細(xì)胞移植中的免疫保護(hù)作用及潛在的免疫豁免機(jī)制，為NPSCs在臨床同種異體胰島移植的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：在上述第一、二部分的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，建立SD大鼠→Wistar糖尿病受鼠的同種異體胰島移

8、植模型。實(shí)驗(yàn)分組如下：①單純胰島細(xì)胞移植組（n=8），1500 IEQ的SD大鼠胰島細(xì)胞移植入Wistar糖尿病大鼠左腎包膜下；②小量NPSCs與胰島細(xì)胞同側(cè)移植組（n=8），1.5×106個(gè)NPSCs與1500 IEQ的SD大鼠胰島細(xì)胞共同移植入糖尿病Wistar大鼠左腎包膜下；③大量NPSCs與胰島細(xì)胞同側(cè)移植組（n=8），1.0×107個(gè)NPSCs與1500 IEQ的SD大鼠胰島細(xì)胞共同移植入糖尿病Wistar大鼠左腎包膜下；④大

9、量NPSCs與胰島細(xì)胞分側(cè)移植組（n=5），1.0×107個(gè)NPSCs移植入Wistar糖尿病大鼠右腎包膜下，同時(shí)將1500 IEQ的SD大鼠胰島細(xì)胞移植入另一側(cè)左腎包膜下；術(shù)后觀察Wistar糖尿病大鼠血糖變化，血糖連續(xù)2次≥11.2mmol/L時(shí)視為胰島細(xì)胞發(fā)生排斥；術(shù)后7天或移植物發(fā)生排斥時(shí)，免疫病理學(xué)比較腎包膜下淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況并檢測(cè)胰島細(xì)胞特異性標(biāo)記物Insulin、NPSCs特異性標(biāo)記因子Sox9和保護(hù)性基因Bcl-2、HO

10、-1的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.5×106個(gè)NPSCs與1500 IEQ胰島細(xì)胞共同移植入受鼠左腎包膜后，胰島移植物平均存活時(shí)間僅稍微延長(zhǎng)到8.33±0.58天；當(dāng)同側(cè)共同移植的NPSCs增加到1.0×107個(gè)時(shí)，胰島移植物平均存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)到16.33±1.53天，與單純胰島移植組（5.67±0.94天）相比，差異有顯著意義（P<0.01）；但是將1.0×107個(gè)NPSCs移植入受體鼠右腎包膜，同時(shí)將1500 IEQ胰島細(xì)胞移

11、植入另一側(cè)即左腎包膜后，胰島移植物平均存活時(shí)間未見明顯延長(zhǎng)（5.25±0.25天），與單純胰島移植組相比差異無(wú)顯著意義（P>0.05）。大量NPSCs與胰島細(xì)胞同側(cè)移植組在移植術(shù)后7天，與單純胰島移植組相比，免疫組化可見，腎包膜炎癥反應(yīng)輕微，淋巴細(xì)胞散在浸潤(rùn)且局限在腎包膜下，包膜內(nèi)可見呈團(tuán)塊狀排列的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)Sox9免疫組化染色證實(shí)該細(xì)胞團(tuán)即為移植的NPSCs；Insulin染色可見腎包膜下有大量的胰島細(xì)胞存在；此外免疫組化還證實(shí)，大量

12、NPSCs組腎包膜下有大量Bcl-2保護(hù)性基因的表達(dá)，但HO-1在各組間均有表達(dá)。
　　 結(jié)論：足量NPSCs對(duì)共同移植的大鼠胰島細(xì)胞具有局部的免疫學(xué)保護(hù)作用，并顯著延長(zhǎng)大鼠胰島細(xì)胞在同種異體腎包膜下的存活時(shí)間；其機(jī)制可能與NPSCs 在局部誘導(dǎo)保護(hù)性基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)有關(guān)，而與FasL的作用無(wú)關(guān)。NPSCs和胰島細(xì)胞不同部位移植則無(wú)保護(hù)作用。
　　 第四部分：新生豬Sertoli細(xì)胞抵御正常人血清中天然抗體介導(dǎo)的補(bǔ)

13、體殺傷作用
　　 目的：探討異種NPSCs 抵御人血清中天然抗體介導(dǎo)的補(bǔ)體殺傷作用及其主要機(jī)制，為NPSCs與胰島細(xì)胞聯(lián)合移植的臨床應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。
　　 方法：以永生化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞系（SV40-PED）作為對(duì)照，F(xiàn)ITC-GS-IB4 lectin 染色流式細(xì)胞儀（FACS）及免疫熒光檢測(cè)并比較NPSCs與SV40-PED天然抗原α-Gal的表達(dá)；FACS檢測(cè)并比較2種細(xì)胞分別與正常人血清（normal human

14、 serum，NHS）中天然抗體IgM、IgG的結(jié)合情況；乳酸脫氫酶釋放試驗(yàn)（LDH法）檢測(cè)20%NHS對(duì)NPSCs及SV40-PED細(xì)胞的殺傷；MTT法檢測(cè)兩種細(xì)胞在20%NHS中培養(yǎng)時(shí)的活性；細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)補(bǔ)體C3c、C4d在NPSCs、SV40-PED的沉積；細(xì)胞免疫組化及免疫熒光檢測(cè)補(bǔ)體攻膜復(fù)合物C5b-9在2種細(xì)胞上的沉積。Western blot檢測(cè)并比較2種細(xì)胞clusterin的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)并比較兩種細(xì)胞補(bǔ)體

15、調(diào)節(jié)蛋白CD46、CD59的表達(dá)。
　　 結(jié)果：NPSCs能夠表達(dá)α-Gal，但明顯弱于SV40-PED（平均熒光強(qiáng)度分別為41.78±2.39和95.17±2.39，P<0.05）；NPSCs雖可與人血清中天然抗體IgG、IgM結(jié)合，但其結(jié)合程度明顯弱于SV40-PED；20%NHS對(duì)NPSCs、SV40-PED的殺傷率分別為24.38%±0.50%和53.13%±14.53%（P<0.01）；2種細(xì)胞在20%NHS中的活性分

16、別為：98.73%±18.84%和52.43%±8.08%（P<0.01）；免疫熒光及組化可見SV40-PED細(xì)胞上分別有補(bǔ)體C3c、C4d和C5b-9的沉積；但NPSCs僅有C3c和C4d沉積，而未見C5b-9沉積；Western blot證明，clusterin在NPSCs的表達(dá)略強(qiáng)于SV40-PED；RT-PCR證實(shí)，NPSCs表達(dá)的CD59顯著強(qiáng)于SV40-PED，而CD46在此兩種細(xì)胞的表達(dá)無(wú)明顯差異。
　　 結(jié)論：N