酪絲亮肽對肝癌的治療作用及影響腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)理研究.pdf

1、目的： 研究三肽化合物酪絲亮肽(YSL)在體內(nèi)外的抗肝癌作用，并初步探討其損傷腫瘤細(xì)胞線粒體，抑制其增殖和誘導(dǎo)死亡的機(jī)制。 方法： 1．以人肝癌細(xì)胞株 BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B、HepG2、SK-HEP-1 和人正常肝細(xì)胞株 Chang 氏肝、HL7702 為研究對象，應(yīng)用MTS法和中空纖維測定法觀察YSL在體內(nèi)外對肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞增殖的影響；建立裸鼠移植瘤模型，觀察YSL對BEL-7

2、402腫瘤生長的抑制作用，并以透射電鏡觀察YSL對裸鼠移植瘤腫瘤細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。 2．應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細(xì)胞周期的影響；并以流式細(xì)胞術(shù)、DNA Ladder檢測和Nucleosome ELISA 的方法觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。 3．應(yīng)用基因芯片技術(shù)分析YSL對人肝癌BEL-7402裸鼠移植瘤腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。 4．以流式細(xì)胞儀和熒光檢

3、測儀觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔開放，線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響。 5．應(yīng)用Western Blot 方法，觀察YSL 體外對人肝癌BEL-7402細(xì)胞線粒體凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-X<,L>蛋白表達(dá)的影響；分離腫瘤細(xì)胞的胞漿組分，觀察YSL對BEL-7402細(xì)胞線粒體釋放促凋亡物質(zhì)細(xì)胞色素C和激活半胱天冬酶Caspase-3 的影響；觀察 YSL 對腫瘤細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白鈣網(wǎng)蛋

4、白(Calreticulin) 和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的 Capase-12 蛋白表達(dá)的影響6．應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot方法觀察，觀察YSL體外對人肝癌BEL-7402細(xì)胞P13K信號(hào)通路調(diào)節(jié)和效應(yīng)因子PTEN、Akt、PDK1、P21、P27、PDK1、MDM2、P53和Bad的mRNA和蛋白表達(dá)，以及磷酸化修飾的影響。 結(jié)果： 1.YSL 在體外(0.4～3.2mg/ml)和體內(nèi)(320～640μg

5、/kg/d)均能夠明顯抑制前述五種人肝癌細(xì)胞株的增殖(P<0.05)，但對正常人肝細(xì)胞株HL7702和Chang氏肝則沒有明顯影響(P>0.05)；組成酪絲亮肽三種氨基酸等摩爾比混合物對腫瘤細(xì)胞的增殖沒有抑制作用，YSL的抗腫瘤作用機(jī)制與其小分子多肽的結(jié)構(gòu)有關(guān)；YSL(320μg/kg/d、640μg/kg/d)能夠明顯抑制人肝癌BElL-7402裸鼠移植瘤的生長(P<0.05)，腫瘤生長抑制率分別為40.04％和52.85％。超微結(jié)構(gòu)

6、研究發(fā)現(xiàn)，YSL可引起腫瘤細(xì)胞的染色質(zhì)溶解，線粒體腫脹，溶解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞出現(xiàn)壞死和凋亡。 2.基因芯片分析結(jié)果顯示YSL可以抑制腫瘤細(xì)胞線粒體呼吸鏈功能相關(guān)基因表達(dá)，影響鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)基因以及與腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因，還可調(diào)節(jié)與藥物代謝相關(guān)基因、癌基因/抑癌基因的表達(dá)。 3.YSL(0.8，1.6mg/ml)能夠在體外阻抑人肝癌 BEL-7402 細(xì)胞的細(xì)胞周期，使G<,0>/G<,

7、1>期細(xì)胞百分比明顯增高，S期百分比明顯降低(P<0.05)；能夠使凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，增加腫瘤細(xì)胞凋亡核小體DNA的產(chǎn)生數(shù)量，形成明顯的DNA Ladder。 4.YSL(0.8，1.6mg/ml)能夠在體外激活BEL-7402細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔的開放，降低線粒體膜電位，影響線粒體膜的通透性，增加腫瘤細(xì)胞中的鈣離子濃度。 5.YSL能夠在體外抑制BEL-7402細(xì)胞中抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-X<,L>的蛋白表

8、達(dá)，誘導(dǎo)線粒體釋放促凋亡物質(zhì)細(xì)胞色素C，增加活化Caspase-3 的數(shù)量；YSL能夠增加BEL-7402細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)蛋白Calreficulin和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路的Capase-12的蛋白表達(dá)。 6.YSL能夠上調(diào)腫瘤細(xì)胞中抑癌基因PTEN的表達(dá)和活性，抑制癌基因Akt的表達(dá)和活性，以及Akt相關(guān)蛋白激酶PDK1的活性。并籍此影響Akt通路的下游事件達(dá)到抗腫瘤效應(yīng)：增加P21、P27的表達(dá)阻抑細(xì)胞周期，抑制腫瘤增殖；通

9、過使癌基因MDM2蛋白產(chǎn)物失活，穩(wěn)定抑癌因子P53的數(shù)量，促進(jìn)腫瘤死亡；解除對促凋亡因子Bad的磷酸化抑制，損傷腫瘤細(xì)胞線粒體，誘導(dǎo)腫瘤凋亡。 結(jié)論： YSL能夠在體內(nèi)外明顯抑制肝癌細(xì)胞的增殖，阻抑腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)凋亡和壞死，而對正常肝細(xì)胞無明顯影響。其作用機(jī)制可能是通過損傷腫瘤細(xì)胞線粒體膜，激活MPTP孔開放，降低線粒體膜電位，進(jìn)而影響線粒體膜通透性，使線粒體中的鈣離子，細(xì)胞色素C等促凋亡物質(zhì)釋放到胞漿中，激活