人參皂苷Rg-,1-對大鼠心肌梗死后血管新生及抗凋亡作用的研究.pdf

1、本文旨在了解人參皂苷Rg<,1>對急性心肌梗死(AMI)后血管新生和對VEGF、HIF-1表達的影響及可能機制，探討人參皂苷Rg<,1>減輕缺血性心肌損傷治療中的可能性。本實驗另通過建立培養(yǎng)心肌細胞的缺氧/復氧模型，觀察心肌細胞凋亡率及其相關(guān)基因的變化，觀察人參皂苷Rg<,1>在缺氧/復氧過程是否有抗凋亡的作用，以探討Rgi在促進血管新生的同時，保護心肌細胞的作用。 實驗方法： 取健康Wistar大鼠104只，建立急性心

2、肌梗死動物模型，對照組和治療組分別于術(shù)后即刻及術(shù)后每天腹腔注射生理鹽水和人參皂菅Rg<,1>(1mg/kg和5mg/kg)，3d、7d、10d、14d分別取材，每組8只。進行心肌酶學和心肌梗死面積測定、免疫組化法觀察梗死區(qū)Ⅷ因子陽性血管數(shù)和VEGF蛋白表達、RT-PCR法檢測VEGF、HIF-1αmRNA的表達。 取乳鼠心肌細胞進行原代培養(yǎng)，制備缺氧/復氧模型，MTT法測人參皂苷Rg<,1>對培養(yǎng)心肌細胞活力的影響，并將心肌細胞

3、分為空白對照組、單純?nèi)毖?復氧組、缺氧/復氧+不同劑量治療組，熒光雙染法觀察心肌細胞凋亡的形態(tài)學變化、流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率、RT-PCR法檢測bcl-2和bax的mRNA表達。 實驗結(jié)果： 1.人參皂苷Rg<,1>對心肌酶學的影響假手術(shù)組心肌酶明顯低于其他各組(P<0.01)，治療組與對照組間差異有顯著性意義(P<0.05)，治療組內(nèi)部差異無顯著意義，提示人參皂苷Rg<,1>有減輕心肌缺血性損傷，保護受損心肌細胞的可

4、能。 2.人參皂苷Rg<,1>對心肌梗死面積的影響心肌梗死區(qū)先后出現(xiàn)凝固性壞死、炎癥細胞浸潤、纖維化、瘢痕組織形成等改變，Rg<,1>治療組梗死面積明顯減少(P<0.05)。 3.人參皂苷Rg<,1>對梗死區(qū)心肌血管新生的影響光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)新生血管靠近心內(nèi)膜的部位明顯多于心外膜，缺血邊緣區(qū)多于梗死中心區(qū)。心肌梗死后梗死區(qū)的血管新生數(shù)量急速上升，治療組保持穩(wěn)定持續(xù)的增加，與對照組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，不同劑

5、量組間微血管密度也有差異(P<0.01)。 4.人參皂苷Rg<,1>對各組梗死區(qū)心肌VEGF表達量的影響心肌梗死后各時段心肌細胞胞漿中VEGF表達較假手術(shù)組均明顯增加，梗死后3d、7d、10d組VEGF表達逐漸升高，組間比較差異顯著(P<0.01)，治療組較對照組明顯升高(P<0.01)，第14天增高趨于停止，對照組甚至有所下降。不同劑量組間VEGF的表達也有顯著性差異。 5．各組大鼠梗死區(qū)心肌VEGF、HIF-1αmR

6、NA的表達各組VEGF、HIF-1αmRNA表達均高于假手術(shù)組，隨時間延長有增高的趨勢，治療組較對照組明顯升高(P<0.01)，14d時VEGF與HIF-1αmRNA表達出現(xiàn)矛盾趨勢，即VEGF增長出現(xiàn)停止或下降，而HIF-1α續(xù)升高。不同劑量治療組間差異有意義(P<0.05)。 6．MTT法測人參皂苷Rg<,1>對培養(yǎng)心肌細胞活力的影響與單純?nèi)毖?復氧組相比，1.0、2.5、5.0 mg/L人參皂苷Rg<,1>組心肌細胞活力隨

7、藥物濃度的增加而增加(P<0.05)，但隨著Rg<,1>劑量的繼續(xù)增加，心肌細胞活力不再增加，而2.5、5.0 mg/L兩組間的作用不明顯，因此選定1.0、2.5mg/L兩種濃度進入下面的實驗。 7．缺氧/復氧下心肌細胞凋亡的形態(tài)學變化在熒光顯微鏡下觀察到AnnexinV-FITC/PI雙染后，對照組的凋亡細胞極少；缺氧/復氧后出現(xiàn)不規(guī)則細胞碎片，一些細胞呈皺縮狀或胞體變小變圓，有的細胞只是細胞膜被染成綠色，為早期凋亡細胞；有的

8、細胞胞核被染成紅色，同時胞膜染成綠色，染色質(zhì)不均勻凝集成塊，出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、固縮、碎裂，為晚期凋亡或壞死細胞。 8．流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率缺氧/復氧組的細胞凋亡率明顯大于藥物治療組(P<0.05)，隨著復氧時間的延長細胞凋亡率無明顯改變；人參皂苷Rg<,1>處理后，細胞凋亡率降低，在一定濃度范圍內(nèi)有量效關(guān)系。 9．缺氧/復氧后心肌細胞bcl-2和bax的mRNA表達缺氧/復氧3小時+人參皂苷Rgl處理組(T1、T3

9、組)中發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax比率明顯高于單純?nèi)毖?復氧處理組(D1組)(P<0.05)，但無明顯的量效關(guān)系；缺氧/復氧18小時+人參皂苷Rgl處理組(T2、T4組)的Bcl-2/Bax比率較3小時處理組有所下降，但仍高于單純?nèi)毖?復氧處理18小時組(D2組)(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1.人參皂苷Rg<,1>有降低梗死后心肌酶釋放，促進心肌梗死后VEGF、HIF-1α的表達，促進血管新生和縮小心肌梗死面積的作用。