人參皂苷Rg-,1-對(duì)大鼠心肌梗死后血管新生及抗凋亡作用的研究.pdf

1、本文旨在了解人參皂苷Rg<,1>對(duì)急性心肌梗死(AMI)后血管新生和對(duì)VEGF、HIF-1表達(dá)的影響及可能機(jī)制，探討人參皂苷Rg<,1>減輕缺血性心肌損傷治療中的可能性。本實(shí)驗(yàn)另通過(guò)建立培養(yǎng)心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧模型，觀察心肌細(xì)胞凋亡率及其相關(guān)基因的變化，觀察人參皂苷Rg<,1>在缺氧/復(fù)氧過(guò)程是否有抗凋亡的作用，以探討Rgi在促進(jìn)血管新生的同時(shí)，保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。 實(shí)驗(yàn)方法： 取健康Wistar大鼠104只，建立急性心

2、肌梗死動(dòng)物模型，對(duì)照組和治療組分別于術(shù)后即刻及術(shù)后每天腹腔注射生理鹽水和人參皂菅Rg<,1>(1mg/kg和5mg/kg)，3d、7d、10d、14d分別取材，每組8只。進(jìn)行心肌酶學(xué)和心肌梗死面積測(cè)定、免疫組化法觀察梗死區(qū)Ⅷ因子陽(yáng)性血管數(shù)和VEGF蛋白表達(dá)、RT-PCR法檢測(cè)VEGF、HIF-1αmRNA的表達(dá)。 取乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，制備缺氧/復(fù)氧模型，MTT法測(cè)人參皂苷Rg<,1>對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞活力的影響，并將心肌細(xì)胞

3、分為空白對(duì)照組、單純?nèi)毖?復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧+不同劑量治療組，熒光雙染法觀察心肌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、RT-PCR法檢測(cè)bcl-2和bax的mRNA表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1.人參皂苷Rg<,1>對(duì)心肌酶學(xué)的影響假手術(shù)組心肌酶明顯低于其他各組(P<0.01)，治療組與對(duì)照組間差異有顯著性意義(P<0.05)，治療組內(nèi)部差異無(wú)顯著意義，提示人參皂苷Rg<,1>有減輕心肌缺血性損傷，保護(hù)受損心肌細(xì)胞的可

4、能。 2.人參皂苷Rg<,1>對(duì)心肌梗死面積的影響心肌梗死區(qū)先后出現(xiàn)凝固性壞死、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化、瘢痕組織形成等改變，Rg<,1>治療組梗死面積明顯減少(P<0.05)。 3.人參皂苷Rg<,1>對(duì)梗死區(qū)心肌血管新生的影響光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)新生血管靠近心內(nèi)膜的部位明顯多于心外膜，缺血邊緣區(qū)多于梗死中心區(qū)。心肌梗死后梗死區(qū)的血管新生數(shù)量急速上升，治療組保持穩(wěn)定持續(xù)的增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性意義(P<0.01)，不同劑

5、量組間微血管密度也有差異(P<0.01)。 4.人參皂苷Rg<,1>對(duì)各組梗死區(qū)心肌VEGF表達(dá)量的影響心肌梗死后各時(shí)段心肌細(xì)胞胞漿中VEGF表達(dá)較假手術(shù)組均明顯增加，梗死后3d、7d、10d組VEGF表達(dá)逐漸升高，組間比較差異顯著(P<0.01)，治療組較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，第14天增高趨于停止，對(duì)照組甚至有所下降。不同劑量組間VEGF的表達(dá)也有顯著性差異。 5．各組大鼠梗死區(qū)心肌VEGF、HIF-1αmR

6、NA的表達(dá)各組VEGF、HIF-1αmRNA表達(dá)均高于假手術(shù)組，隨時(shí)間延長(zhǎng)有增高的趨勢(shì)，治療組較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，14d時(shí)VEGF與HIF-1αmRNA表達(dá)出現(xiàn)矛盾趨勢(shì)，即VEGF增長(zhǎng)出現(xiàn)停止或下降，而HIF-1α續(xù)升高。不同劑量治療組間差異有意義(P<0.05)。 6．MTT法測(cè)人參皂苷Rg<,1>對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞活力的影響與單純?nèi)毖?復(fù)氧組相比，1.0、2.5、5.0 mg/L人參皂苷Rg<,1>組心肌細(xì)胞活力隨

7、藥物濃度的增加而增加(P<0.05)，但隨著Rg<,1>劑量的繼續(xù)增加，心肌細(xì)胞活力不再增加，而2.5、5.0 mg/L兩組間的作用不明顯，因此選定1.0、2.5mg/L兩種濃度進(jìn)入下面的實(shí)驗(yàn)。 7．缺氧/復(fù)氧下心肌細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化在熒光顯微鏡下觀察到AnnexinV-FITC/PI雙染后，對(duì)照組的凋亡細(xì)胞極少；缺氧/復(fù)氧后出現(xiàn)不規(guī)則細(xì)胞碎片，一些細(xì)胞呈皺縮狀或胞體變小變圓，有的細(xì)胞只是細(xì)胞膜被染成綠色，為早期凋亡細(xì)胞；有的

8、細(xì)胞胞核被染成紅色，同時(shí)胞膜染成綠色，染色質(zhì)不均勻凝集成塊，出現(xiàn)染色質(zhì)邊集、固縮、碎裂，為晚期凋亡或壞死細(xì)胞。 8．流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率缺氧/復(fù)氧組的細(xì)胞凋亡率明顯大于藥物治療組(P<0.05)，隨著復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯改變；人參皂苷Rg<,1>處理后，細(xì)胞凋亡率降低，在一定濃度范圍內(nèi)有量效關(guān)系。 9．缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞bcl-2和bax的mRNA表達(dá)缺氧/復(fù)氧3小時(shí)+人參皂苷Rgl處理組(T1、T3

9、組)中發(fā)現(xiàn)Bcl-2/Bax比率明顯高于單純?nèi)毖?復(fù)氧處理組(D1組)(P<0.05)，但無(wú)明顯的量效關(guān)系；缺氧/復(fù)氧18小時(shí)+人參皂苷Rgl處理組(T2、T4組)的Bcl-2/Bax比率較3小時(shí)處理組有所下降，但仍高于單純?nèi)毖?復(fù)氧處理18小時(shí)組(D2組)(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1.人參皂苷Rg<,1>有降低梗死后心肌酶釋放，促進(jìn)心肌梗死后VEGF、HIF-1α的表達(dá)，促進(jìn)血管新生和縮小心肌梗死面積的作用。