人參皂苷Rg1對營養(yǎng)缺乏心肌細(xì)胞自噬與凋亡的動態(tài)調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景：自噬在缺血性心血管疾病中的作用研究已經(jīng)成為一個新的熱點。研究表明，心肌細(xì)胞在營養(yǎng)和能量缺乏、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)大量聚集等應(yīng)激狀態(tài)下，自噬可以被激活。一方面，通過自噬，細(xì)胞可以在病理條件下延長存活時間;另一方面，過度激活的自噬可能引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。目前，自噬與凋亡的關(guān)系并不十分清楚。已知的是，自噬與凋亡是兩個動態(tài)變化的事件，它們通過內(nèi)在的分子機(jī)制相互影響、相互轉(zhuǎn)化，二者的動態(tài)平衡或失衡決定了細(xì)胞的生存或死亡。因此闡明自噬和凋亡的動態(tài)關(guān)

2、系對細(xì)胞命運轉(zhuǎn)歸的作用機(jī)制具有重要意義，也有助于尋找治療心肌缺血性疾病的有效措施。
　　心肌缺血在中醫(yī)范疇屬于冠脈瘀阻，臟器失養(yǎng)。具有益氣活血功效的中藥或有效成分對缺血、缺氧的心肌具有保護(hù)作用已經(jīng)得到證實。機(jī)制包括擴(kuò)張冠脈、改善心肌代謝、促進(jìn)血管新生、抑制細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、抑制凋亡等。而干預(yù)心肌細(xì)胞的自噬作用可能是中藥治療心肌缺血的機(jī)制之一，但是其對自噬的調(diào)節(jié)作用研究結(jié)果尚不一致，機(jī)制也不明確。這可能與沒有重視“自噬和凋亡是兩個

3、動態(tài)變化的過程”有關(guān)。單一時間點的研究不能全面的反應(yīng)自噬和凋亡在病理狀態(tài)下的動態(tài)變化，更不能反應(yīng)二者的動態(tài)變化如何影響細(xì)胞命運轉(zhuǎn)歸，因而也不能全面反應(yīng)中藥對自噬和凋亡相互作用動態(tài)變化的調(diào)節(jié)作用。所以，連續(xù)的觀察中藥、自噬、凋亡三者的動態(tài)關(guān)系對闡明藥物的作用和機(jī)制是十分必要的。
　　目的：動態(tài)觀察心肌細(xì)胞在持續(xù)營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，自噬與凋亡的變化趨勢，闡釋自噬與凋亡相互作用的規(guī)律;通過動態(tài)觀察益氣藥有效成分對營養(yǎng)缺乏心肌細(xì)胞自噬、凋亡及

4、自噬與凋亡的相互作用相關(guān)指標(biāo)的影響，闡明藥物調(diào)節(jié)營養(yǎng)缺乏心肌細(xì)胞自噬與凋亡的作用機(jī)制。為完善益氣藥臨床治療缺血性心血管疾病的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分、營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬與凋亡的變化趨勢及相互關(guān)系
　　1.持續(xù)營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞自噬與凋亡的變化趨勢建立H9c2心肌細(xì)胞持續(xù)營養(yǎng)缺乏（將正常培養(yǎng)液換為無糖無血清培養(yǎng)液）0，30，60，90，120，150，180，210，240，270

5、，300，330，360min模型。篩選出細(xì)胞活力變化呈現(xiàn)較強(qiáng)時間依賴性的時間點。在篩選出的時間點提取細(xì)胞蛋白，Westernblot檢測自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，觀察自噬與凋亡的變化趨勢。
　　2.營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬與凋亡的相互關(guān)系根據(jù)實驗1結(jié)果，在自噬水平最高時間點使用自噬抑制劑和自噬促進(jìn)劑處理細(xì)胞。Westernblot檢測兩種處理條件下凋亡蛋白的表達(dá)水平，觀察自噬與凋亡的相互關(guān)系。
　　第二部分、人參皂苷R

6、g1對持續(xù)營養(yǎng)缺乏心肌細(xì)胞自噬與凋亡的影響
　　1.人參3種有效成分對持續(xù)營養(yǎng)缺乏心肌細(xì)胞的藥效作用篩選根據(jù)第一部分實驗1結(jié)果選擇自噬水平最高時間點建立H9c2細(xì)胞營養(yǎng)缺乏模型，MTT法、Westernblot分別考察益氣藥有效成分對細(xì)胞活力、自噬蛋白、凋亡蛋白表達(dá)量的影響，篩選最佳中藥有效成分。
　　2.人參皂苷Rg1對持續(xù)營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響用最佳藥效中藥有效成分處理營養(yǎng)缺乏0-240min細(xì)胞。連續(xù)多時間點

7、MTT法檢測細(xì)胞活力;Westernblot檢測細(xì)胞凋亡蛋白;流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡率。
　　3.人參皂苷Rg1對持續(xù)營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬的影響檢測凋亡水平同時進(jìn)行自噬檢測:Westernblot檢測細(xì)胞自噬蛋白;活細(xì)胞工作站觀察GFP-LC3的變化。并進(jìn)一步使用自噬工具藥驗證中藥有效成分對自噬流的影響。
　　第三部分、人參皂苷Rg1通過PI3K-AKT信號通路對持續(xù)營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬與凋亡的調(diào)節(jié)

8、作用在中藥有效成分藥效最顯著的時間點建立H9c2細(xì)胞營養(yǎng)缺乏模型，考察中藥有效成分對PI3K-AKT信號通路關(guān)鍵蛋白及與其相關(guān)聯(lián)的自噬、凋亡蛋白PI3K、AKT、P-AKT、mTOR、LC3、caspase9、caspase3表達(dá)量的影響。
　　第四部分、人參皂苷Rg1通過Beclin1-Bcl-2途徑對持續(xù)營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞自噬與凋亡相互關(guān)系的調(diào)節(jié)作用
　　1.人參皂苷Rg1對持續(xù)營養(yǎng)缺乏心肌細(xì)胞Beclin1、Bcl

9、-2蛋白表達(dá)的影響建立H9c2細(xì)胞營養(yǎng)缺乏0-240min模型，Westernblot檢測Beclin1與Bcl-2蛋白表達(dá)趨勢。
　　2.人參皂苷Rg1對持續(xù)營養(yǎng)缺乏心肌細(xì)胞Beclin1-Bcl-2相互關(guān)系的影響通過連續(xù)多個時間點IP觀察人參皂苷Rg1對H9c2細(xì)胞營養(yǎng)缺乏0-240min期間Beclin1與Bcl-2的相互作用。并將CFP-Beclin1、YFP-Bcl-2共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，通過FRET現(xiàn)象觀察藥物在營養(yǎng)缺

10、乏開始至細(xì)胞死亡期間，對Beclin1與Bcl-2相互關(guān)系的影響。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　　1.與正常對照組(營養(yǎng)缺乏0min)比較，營養(yǎng)缺乏誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞活力逐漸下降。而在0-240min期間，細(xì)胞活力的降低具有較好的時間依賴性。
　　2.與正常對照組比較，模型組caspase3整體變化的趨勢是先逐漸上升，然后下降，30-210minn期間具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在120min時達(dá)到高峰。模型組

11、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在細(xì)胞營養(yǎng)缺乏30-150min期間逐漸上升，到90min時開始具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），150min時表達(dá)量到達(dá)高峰，然后逐漸下降。p62表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，到90min時開始具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);
　　3.與模型組比較，3-MA組caspase3表達(dá)量升高(P＜0.05);相反，Rap組caspase3表達(dá)量降低(P＜0.05)。
　　第二部分
　　1.與模型組比較，人參皂苷R

12、c100μmol·L-1，人參皂苷Re25，50，100μmol·L-1，人參皂苷Rg125，50，100μmol·L-1，對H9c2細(xì)胞活力的降低有恢復(fù)作用(P＜0.01或P＜0.05);人參皂苷Rc100μmol·L-1，人參皂苷Re50，100μ mol·L-1，人參皂苷Rg125，50，100μmol·L-1，能夠降低caspase3表達(dá)量（P＜0.01或P＜0.05）;人參皂苷Rg150，100μmol·L-1，能夠降低LC3

13、表達(dá)量;對三個指標(biāo)均有明顯影響的中藥有效成分為:人參皂苷Rg1，最佳劑量為:100μmol·L-1。
　　2.與模型組比較，MTT結(jié)果顯示:人參皂苷Rg1（25，50，100μmol·L-1）在營養(yǎng)缺乏30-240min間各時間點均對細(xì)胞活力有增加作用，并且在90-240min期間存在量效關(guān)系。藥效最佳的劑量為:100μmol·L-1。Westernblot結(jié)果顯示:人參皂苷Rg1在營養(yǎng)缺乏90-240min降低H9c2細(xì)胞cas

14、pase3表達(dá)量(P＜0.05)。
　　與正常對照組比較，流式細(xì)胞術(shù)檢測、TUNEL檢測結(jié)果顯示:細(xì)胞凋亡率隨營養(yǎng)缺乏時間的延長增加明顯，至60min時具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，并具有時間依賴性。與模型組比較:人參皂苷Rg1在營養(yǎng)缺乏60-240min能夠H9c2降低細(xì)胞凋亡率(P＜0.05)。
　　3.與正常對照組比較，模型組的GFP-LC3熒光強(qiáng)度在營養(yǎng)缺乏0-1.5h期間增加明顯，并且細(xì)胞伴隨形態(tài)收縮;在營養(yǎng)缺乏

15、4h左右時，細(xì)胞收縮成圓形，停止運動，熒光淬滅。人參皂苷Rg1使GFP-LC3熒光持續(xù)時間延長至12h左右，同時伴隨細(xì)胞維持正常形態(tài)時間的延長。
　　與模型組比較，Westernblot結(jié)果顯示:人參皂苷Rg1在細(xì)胞饑餓30-90min間提高了LC3的表達(dá)量(P＜0.05)，并將其表達(dá)高峰提前至90min;同時降低了P62在30-120min間的表達(dá)量(P＜0.05)。
　　在H9c2細(xì)胞營養(yǎng)缺乏90min模型中，當(dāng)氯喹與人

16、參皂苷Rg1同時作用于細(xì)胞時， LC3表達(dá)量均明顯高于模型組、氯喹組和人參皂苷Rg1組（P＜0.05）。
　　第三部分
　　與模型組比較，人參皂苷Rg1提高了PI3K、AKT、P-AKT、LC3表達(dá)量（P＜0.05或P＜0.01），降低了mTOR、caspase9、caspase3表達(dá)量(P＜0.05)。
　　第四部分
　　與模型組比較，Westernblot結(jié)果顯示:人參皂苷Rg1在營養(yǎng)缺乏90-240min提

17、高Beclin1表達(dá)量，在90-210min提高Bcl-2表達(dá)量。IP結(jié)果顯示:與模型組比較，人參皂苷Rg1使與Beclin1結(jié)合的Bcl-2表達(dá)量時間依賴性降低，在30min時開始具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。游離Bcl-2表達(dá)量時間依賴性升高，在30min時開始具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在營養(yǎng)缺乏150min模型中，人參皂苷Rg1(25，50，100μmol·L-1)使與Beclin1結(jié)合的Bcl-2表達(dá)量劑量依賴性降低（P

18、＜0.05），游離Bcl-2表達(dá)量劑量依賴性升高（P＜0.05）。
　　FRET結(jié)果顯示:在營養(yǎng)模型建立前及建立后初期，Beclin1-Bcl-2相互作用處于穩(wěn)定狀態(tài);至模型建立后240min，Beclin1-Bcl-2相互作用水平開始逐漸升高，420min時到達(dá)高峰，然后下降，480min進(jìn)入平臺期。經(jīng)人參皂苷Rg1處理后，Beclin1-Bcl-2相互作用變化趨勢與模型組相似，但是OD值降低，并且具有明顯的量效關(guān)系（P＜0.0

19、5或P＜0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.在心肌細(xì)胞持續(xù)營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，自噬與凋亡均發(fā)生，但是變化趨勢不同。當(dāng)LC3表達(dá)量到達(dá)高峰時，caspase3表達(dá)量開始下降。當(dāng)抑制自噬時，凋亡水平升高;相反，當(dāng)促進(jìn)自噬時，凋亡水平下降。
　　2.人參皂苷Rg1對持續(xù)營養(yǎng)缺乏的心肌細(xì)胞自噬與凋亡均有調(diào)節(jié)作用。表現(xiàn)為通過提前LC3、p62的表達(dá)峰值及提高Beclin1表達(dá)量促進(jìn)自噬;通過降低caspase3表達(dá)量及減少細(xì)胞凋亡率抑