人參皂苷Rg1對局灶性腦梗死小鼠血管新生機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　腦血管病對人類健康危害極大，發(fā)病率高，致殘、致死率高，復(fù)發(fā)率高，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，為病人本身及其所在家庭造成極大負(fù)面影響。腦梗死是腦血管病中非常常見的一種。新生的血管可以為缺血腦組織提供氧、營養(yǎng)物質(zhì)以及神經(jīng)營養(yǎng)支持，越來越多的證據(jù)表明腦梗死后的血管新生可以緩解病人的癥狀、改善病人的預(yù)后，促進(jìn)血管新生機(jī)制的研究成為了治療缺血性腦梗死研究的新靶點(diǎn)。許多中醫(yī)藥已經(jīng)被證實(shí)在缺血性腦血管病中通過不同機(jī)制有治療作用。人參皂苷Rg1(Gi

2、nsenoside Rg1)是人參皂苷的一種成分，主要存在于人參屬藥材中，可快速緩解疲勞、改善學(xué)習(xí)記憶、延緩衰老，具有興奮中樞神經(jīng)作用、抑制血小板凝集作用，已被證實(shí)在心肌梗死、糖尿病肢體梗死、皮膚缺血壞死以及新生兒缺血缺氧性腦病后均存在促進(jìn)血管新生的作用。并有實(shí)驗(yàn)研究表明人參皂苷 Rg1具有在促進(jìn)血管再生的作用以及增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞血管新生能力的作用。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制小鼠大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlu

3、sion, MCAO)應(yīng)用人參皂苷Rg1進(jìn)行干預(yù)，評價人參皂苷Rg1對于腦缺血后血管新生的作用，旨在證實(shí)其對于新生血管的促進(jìn)作用并探討其可能機(jī)制。
　　方法：
　　采用健康雄性的成年 C57BL/6小鼠，應(yīng)用結(jié)扎右側(cè)頸動脈、顯微鏡下電燒灼大腦中動脈皮層分支制備大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。實(shí)驗(yàn)分組如下：sham組（假手術(shù)組）、MCAO（梗死組）、GRg1-

4、L（低劑量治療組）、GRg1-M（中劑量治療組）、GRg1-H（高劑量治療組）。各組小鼠均在成功造模后即刻給藥，給藥方式為腹腔注射，給藥劑量如下：低劑量治療組(12.5mg/kg)，中劑量治療組25mg/kg，高劑量治療組(50mg/kg)，連續(xù)給藥14天。并在治療后1天、7天、14天、21天、28天分別觀測記錄Rotarod及mNSS神經(jīng)功能評分，于28天進(jìn)行HE染色測定腦梗死體積，于3、7、14天進(jìn)行免疫印跡(western blo

5、t)測量VEGF、HIF-1α、VEGFR-2的蛋白表達(dá)含量，于造模前、造模后即刻、造模后1、3、7、14天應(yīng)用激光散斑儀觀測腦血流。
　　結(jié)果：
　　1人參皂苷Rg1改善腦缺血小鼠的神經(jīng)功能缺損
　　本實(shí)驗(yàn)對假手術(shù)組、梗死組、低劑量治療組、中劑量治療組、高劑量治療組分別在腦梗死手術(shù)后1、7、14、21、28天進(jìn)行了rotarod及mNSS神經(jīng)功能評分，應(yīng)用Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計。在造模成功后24小時，即梗死后1天，除

6、假手術(shù)組外的各組小鼠均出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損癥狀，即左側(cè)肢體偏癱，且神經(jīng)功能評分升高，各組之間神經(jīng)功能評分未見明顯差異(P>0.05)。高劑量治療組與梗死組相比，神經(jīng)功能評分顯著降低，在腦梗死術(shù)后第7天開始有了明顯差異(P<0.05)，且這一差異一直持續(xù)到腦梗死術(shù)后28天。對于跑輪實(shí)驗(yàn)，從腦梗死術(shù)后第七天開始高劑量人參皂苷Rg1與梗死組出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)，這一差異一直持續(xù)到腦梗死術(shù)后第28天。從腦梗死術(shù)后第7天開始至腦梗死術(shù)后第2

7、8天，中劑量治療組、低劑量治療組間或出現(xiàn)與梗死組出現(xiàn)顯著差異的情況，但是中劑量治療組、低劑量治療組與高劑量治療組之間一直存在差異(P<0.05)，說明人參皂苷Rg1確實(shí)有改善腦梗死后小鼠神經(jīng)功能的癥狀，且適宜的治療劑量為高劑量，即50mg/kg。
　　2人參皂苷Rg1未顯著降低小鼠腦梗死體積
　　在術(shù)后第28天，取各組小鼠腦組織并進(jìn)行HE染色，發(fā)現(xiàn)sham組小鼠的腦組織并未出現(xiàn)梗死灶，其余組小鼠均出現(xiàn)梗死灶，各個劑量治療組與

8、梗死組小鼠比較梗死灶體積減小但并無統(tǒng)計學(xué)意義。(MCAO vs. GRg1-H vs. GRg1-M vs. GRg1-L:11.76％±2.02% vs.9.98%±1.03% vs.10.03%±2.11%vs.10.99%±2.10%, P>0.05)。這一結(jié)果提示人參皂苷Rg1不能顯著降低小鼠腦梗死體積。
　　3人參皂苷Rg1改變VEGF、HIF-1α、VEGFR-2蛋白含量的表達(dá)
　　本實(shí)驗(yàn)通過免疫印跡法(west

9、ern blot)測定VEGF、HIF-1α、VEGFR-2三種血管新生相關(guān)蛋白在小鼠腦梗死并用人參皂苷 Rg1處理后的相對表達(dá)。小鼠接受腦梗死手術(shù)后的第3天、第7天、第14天后（腹腔注射給藥，腦梗死后立即給藥，連續(xù)給藥14天，一天一次，劑量處理如上述實(shí)驗(yàn)）斷頭取腦，按照western blot操作步驟測定VEGF、HIF-1α、VEGFR-2三種蛋白表達(dá)含量，利用ImageJ以及Prism軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，結(jié)果表明從小鼠腦梗死后第14

10、天開始，各治療組的VEGF、HIF-1α、VEGFR-2蛋白的表達(dá)與梗死組相比都有了明顯上調(diào)(P<0.05),但是各不同劑量治療組之間的VEGF、HIF-1α、VEGFR-2蛋白表達(dá)并沒有出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)，但仍可看出越高劑量的人參皂苷Rg1處理后VEGF、HIF-1α、VEGFR-2蛋白表達(dá)含量越高。這一實(shí)驗(yàn)說明人參皂苷Rg1通過上調(diào)血管新生相關(guān)蛋白VEGF、HIF-1α、VEGFR-2來促進(jìn)血管新生。
　　4人參皂苷

11、Rg1改善腦梗死后血流
　　在造模前、造模后即刻，以及造模后1、3、7、14天用激光散斑儀觀測各組小鼠腦血流。觀察發(fā)現(xiàn)：除sham組小鼠外，其他組小鼠在造模成功后腦血流均明顯下降，與造模前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，從造模后第14天開始，高劑量治療組與梗死組相比小鼠腦血流有明顯改善，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這一結(jié)果說明人參皂苷Rg1可以有效改善腦梗死后小鼠的腦血流，且高劑量(50mg/kg)對腦血流改善效果