豬CD4-CD8互斥分化機制的單類細胞轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、一直以來抗病育種都是養(yǎng)豬業(yè)的重要工作之一，提高豬自身免疫能力是從根源上提高豬的抗病能力。T淋巴細胞是淋巴細胞的重要組成部分，在免疫調(diào)節(jié)功能上扮演重要角色，但與其相關(guān)的研究多涉及單基因或重要的信號通路，而近年來高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展，從全基因組角度解析T淋巴細胞的作用機理很有必要。CD4/CD8 T淋巴細胞在胸腺的發(fā)育經(jīng)歷雙陰性、雙陽性和單陽性三個時期，不同分化時期基因的表達可能存在差異。本研究旨在采集新鮮的仔豬胸腺組織，制備胸腺細胞懸浮

2、液，標記CD3、CD4、CD8流式抗體，利用流式細胞術(shù)分選胸腺CD4/CD8四類T淋巴細胞，經(jīng)過單類細胞測序，分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，挖掘差異表達基因，為探究T細胞發(fā)育的相關(guān)分子機制提供參考依據(jù)。得到的具體結(jié)果如下:
　　(1)采集仔豬胸腺組織，通過酶消化處理，制備成細胞懸浮液，通過流式細胞術(shù)分選得到CD4-CD8-、CD4+CD8+、CD4+ CD8-和CD4-CD8+四類T淋巴細胞。
　　(2)利用單類細胞測序得到胸腺CD4/C

3、D8 T淋巴細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并進行分析，發(fā)現(xiàn)DN-DP、DP-CD4單陽、DP-CD8單陽三個發(fā)育階段有大量的差異表達基因。
　　(3)按照發(fā)育主線分析差異基因的表達，發(fā)現(xiàn)很多差異基因，在T細胞雙陰性至雙陽性發(fā)育階段，129個基因顯著上調(diào)，125個基因顯著下調(diào);雙陽性到CD4單陽性分化階段，基因表達情況為顯著上調(diào)的44個，顯著下調(diào)的104個;雙陽性到CD8單陽性T細胞分化時期，顯著上調(diào)的基因為35個，顯著下調(diào)的為76個;DN-DP

4、-CD4和DN-DP-CD8發(fā)育階段基因差異表達可分為9種情況，每種情況的差異基因不等。
　　(4)基因表達在DN—DP階段差異不顯著時，DP—CD4 SP階段顯著下調(diào)與DP—CD8 SP階段顯著下調(diào)的基因有8個相同的，SLA-DQA、PTCRA、ADM5、ID1、DCK、ARPP21、XKRX、TRIM58;DP—CD4 SP階段顯著上調(diào)與DP—CD8 SP階段顯著上調(diào)的基因有1個相同的，IL17R?；虮磉_在DN—DP階段顯著

5、上調(diào)時，DP—CD4 SP階段顯著下調(diào)與DP—CD8 SP階段顯著下調(diào)基因有12個相同的，C1QA、 PCD1B、CD1D、EPCAM、GSX2、COL5A2、FABP6、CD1A、RAG1、RORC、BST1、C17(f67)，其中DP至CD4階段顯著下調(diào)的基因中有CD8A、CD8B，DP至CD8階段顯著下調(diào)基因中有CD4。
　　(5)對T細胞分化的三個階段的差異基因開展GO富集分析，發(fā)現(xiàn)差異基因均參與免疫系統(tǒng)過程，調(diào)節(jié)細胞活化