竹節(jié)人參皂苷對(duì)乙醇性肝損傷的保護(hù)機(jī)理研究.pdf

1、酗酒既是個(gè)社會(huì)問(wèn)題也是個(gè)醫(yī)學(xué)問(wèn)題，因酗酒導(dǎo)致的急慢性酒精中毒、酒精性脂肪肝、慢性肝炎、肝硬化等疾病嚴(yán)重危害著人們的健康。大量飲酒過(guò)后，血液中乙醇濃度明顯升高，出現(xiàn)各種醉酒癥狀。乙醇主要在肝臟中通過(guò)乙醇氧化系統(tǒng)進(jìn)行代謝，同時(shí)產(chǎn)生大量自由基O2-·、OH·，以及乙醇自身產(chǎn)生的自由基C2H5O-和C2H5OH-，當(dāng)產(chǎn)生自由基超出了機(jī)體的清除能力，便造成機(jī)體組織損傷。所以普遍認(rèn)為乙醇導(dǎo)致肝損傷，其機(jī)制之一是通過(guò)激活O2產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致肝細(xì)胞膜脂

2、質(zhì)過(guò)氧化及肝細(xì)胞損傷。
　　 竹節(jié)人參(Panax Japonics.C.A.Mey)系五加科植物，為《中華人民共和國(guó)藥典》收載的名貴常用中藥，通常被認(rèn)為具有抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗衰老、抗疲勞、抗病毒、抗腫瘤、保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)心血管系統(tǒng)、保護(hù)內(nèi)分泌系統(tǒng)、保護(hù)免疫系統(tǒng)等多方面的功能，其主要化學(xué)成份為竹節(jié)參皂苷。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)人參總皂苷可顯著提高多種模型(如：運(yùn)動(dòng)、衰老、腦缺血再灌注損傷、高脂血癥、等)動(dòng)物血清、肝臟中

3、SOD、CAT、GSH-PX活性，同時(shí)降低MDA含量，從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化。因此，本研究利用循環(huán)超聲波提取了人工栽培的竹節(jié)人參總皂苷，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)-質(zhì)譜(HPLC-ELSD-MS)分析了竹節(jié)人參皂苷單體及含量組成，并以抗氧化性為著手點(diǎn)，研究了竹節(jié)人參總皂苷對(duì)模型小鼠、人胚肝細(xì)胞L-O2乙醇性損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)理，同時(shí)分析了不同竹節(jié)人參皂苷單體對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞L-O2的保護(hù)作用及作用機(jī)理，主要研究結(jié)果如下：
　　

4、 1、通過(guò)竹節(jié)人參總皂苷提取，HPLC-ELSD分離獲得6個(gè)皂苷單體，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，結(jié)合HPLC-ESI-MS分析，可知分別為Rg1、Re、Rf、F3、Rg2和Rd，其在人參總皂苷中的含量分別為：12.23％、16.24％、16.95％、7.51％、8.53％和11.47％。
　　 2、給乙醇性肝損傷模型小鼠灌胃給予竹節(jié)人參總皂苷，氣相色譜法(GC)測(cè)定小鼠血清、尿液中乙醇濃度，分光光度法測(cè)定小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草

5、轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性以及血清、肝組織中丙二醛(MDA)含量、還原型谷光甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-PX)活性等生化指標(biāo)，光鏡、透射電鏡觀察肝組織超微病理變化，研究竹節(jié)人參總皂苷對(duì)小鼠乙醇性肝損傷的保護(hù)效果及作用機(jī)制；結(jié)果顯示，竹節(jié)人參總皂苷不具有抑制乙醇在胃腸道吸收作用，但能顯著降低乙醇肝損傷模型小鼠血清ALT、AST酶活性及血清、肝組織MDA含量，提高模型小鼠

6、血清、肝臟中GSH含量和抗氧化酶GSH-PX、CAT、SOD的活性。在血清中，竹節(jié)人參總皂苷50 mg/kg劑量組小鼠血清GSH含量、GSH-PX、CAT和SOD活性與正常組小鼠無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在肝臟中，竹節(jié)人參總皂苷50 mg/kg劑量組小鼠肝臟GSH-PX、SOD活性可恢復(fù)至正常水平，與正常組小鼠無(wú)顯著性差異(P>0.05)；GSH、CAT水平雖然顯著提高，但仍顯著低于正常組(P<0.01)；竹節(jié)人參總皂苷(50 mg

7、/k)可降低肝組織病變，促進(jìn)肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，肝索、肝竇無(wú)明顯異常，肝細(xì)胞體積逐漸恢復(fù)正常，細(xì)胞核染色質(zhì)分布較均勻，核膜整形光滑，線粒體結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，內(nèi)(嵴)外膜完整，基質(zhì)均勻，但部分線粒體嵴仍有些紊亂。以上結(jié)果表明，竹節(jié)人參總皂苷具有提高機(jī)體抗氧化功能，特別是對(duì)肝細(xì)胞及細(xì)胞器線粒體的結(jié)構(gòu)完整性具有明顯的保護(hù)作用。
　　 3、通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)觀察竹節(jié)人參總皂苷對(duì)正常及乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2活性的影響，分光光度法測(cè)定肝細(xì)

8、胞內(nèi)液MDA含量和SOD、GSH-PX、CAT活性變化，以及RT-PCR分析肝細(xì)胞內(nèi)SOD1、SOD2、SOD3、GSH-PX1、GSH-PX2、CAT mRNA水平變化，研究竹節(jié)人參總皂苷對(duì)乙醇損傷人胚肝細(xì)胞L-O2的保護(hù)作用及作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)正常肝細(xì)胞，竹節(jié)人參總皂苷(100μg/mL)表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)L-O2增殖作用，當(dāng)竹節(jié)人參總皂苷濃度達(dá)400μg/mL時(shí)，則表現(xiàn)出明顯的抑制細(xì)胞增殖作用；對(duì)乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2，竹節(jié)人

9、參總皂苷(100μg/mL)表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用，其肝細(xì)胞內(nèi)液MDA含量、SOD、GSH-PX活性可恢復(fù)至正常水平(P>0.05)，CAT活性雖顯著升高，但仍顯著低于正常組(P<0.01)。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，竹節(jié)人參總皂苷(100μg/mL)可促進(jìn)SOD1、SOD2、SOD3、GSH-PX1、GSH-PX2、CAT mRNA表達(dá)，其中GSH-PX3顯著高于正常組(P<0.01)，SOD1、SOD3與正常組無(wú)顯著差異(P>0.05)，

10、SOD2、CAT雖顯著提高，但仍低于正常對(duì)照(P<0.01)，該結(jié)果與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明竹節(jié)人參總皂苷發(fā)揮抗氧化作用與促進(jìn)抗氧化酶SOD、GSH-PX、CAT特別是SOD1、SOD3、GSH-PX3mRNA表達(dá)有關(guān)。
　　 4、通過(guò)清除羥自由基(OH-)和超氧陰離子自由基(O2-·)試驗(yàn)，進(jìn)行竹節(jié)人參總皂苷體外抗氧化能力評(píng)價(jià)。結(jié)果竹節(jié)人參總皂苷呈現(xiàn)出明顯的清除OH·效應(yīng)，并且其效果優(yōu)于Vc，當(dāng)濃度為12.5-1600μg/m

11、L時(shí)，竹節(jié)人參總皂苷和Vc對(duì)OH·清除率分別為3.37-59.47％和3.10-31.79％；竹節(jié)人參總皂苷對(duì)聯(lián)苯三酚自氧化具有一定的抑制作用，能清除O2-·，但清除能力要低于Vc，當(dāng)濃度為12.5-1600μg/mL時(shí)，竹節(jié)人參總皂苷和Vc清除率分別為1.01-6.87％和0.89-15.98％。研究結(jié)果表明，竹節(jié)人參總皂苷在乙醇性肝損傷保護(hù)作用中，不僅可提高抗氧化劑GSH含量以及抗氧化酶GSH-PX、CAT、SOD的活性，同時(shí)具有直

12、接清除肝代謝過(guò)程產(chǎn)生的-OH、O2-·自由基，亦或者是兩者的協(xié)同作用達(dá)到對(duì)肝細(xì)胞的保護(hù)。
　　 5、通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率，分光光度法測(cè)定肝細(xì)胞內(nèi)液MDA含量、SOD及GSH-PX活性，研究竹節(jié)人參皂苷單體對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞L-O2的保護(hù)作用及作用機(jī)理。結(jié)果顯示，Rg10.16 mg/mL、Re1.28 mg/mL和Rf0.64 mg/mL可促進(jìn)正常肝細(xì)胞L-O2增殖，增殖率分別為22.68％、34.80％和28.47％(P<

13、0.01)；Rd0.16mg/mL和F31.28 mg/mL對(duì)正常肝細(xì)胞L-O2生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用，抑制率分別為49.69％和43.33％(P<0.01)。對(duì)乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2，Rg10.16 mg/mL、Re1.28 mg/mL和Rf0.64 mg/mL具有明顯的保護(hù)作用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率由乙醇損傷模型組的50.37％分別降低為23.31％、26.90％和26.58％(P<0.01)；Rd0.16mg/mL和F31.28

14、 mg/mL則加劇乙醇對(duì)肝細(xì)胞的損傷，抑制率高達(dá)83.18％和64.79％(P<0.01)。乙醇損傷模型組肝細(xì)胞L-O2內(nèi)乙醇代謝產(chǎn)生MDA含量、抗氧化酶SOD和GSH-PX活性分別為1.35±0.05μmol/mL、26.45±2.78 U/mL和67.04±4.27U/mL，Rg10.16 mg/mL、Re1.28 mg/mL和Rf0.64 mg/mL可降低乙醇損傷的肝細(xì)胞L-O2內(nèi)MDA含量，分別降低為1.17±0.04、1.21

15、±0.03和1.21±0.05μmol/mL(P<0.01)；提高SOD活性，分別升高為38.32±4.85、35.58±4.43和38.96±3.27 U/mL(P<0.01)；增強(qiáng)GSH-PX活性，分別升高為86.30±5.72、78.40±3.54和84.25±4.35U/mL(P<0.01)。以上結(jié)果表明，人參皂苷單體Rg1、Re和Rf對(duì)乙醇損傷肝細(xì)胞L-O2具有明顯的保護(hù)作用，清除乙醇代謝過(guò)程中產(chǎn)生的MDA以及提高抗氧化酶SO