人參皂苷糖苷酶Ⅳ型及其定向催化人參三醇皂苷的研究.pdf

1、人參是最著名的中草藥之一，其主要的活性成分是人參皂苷。天然含量高的人參皂苷活性低、人體吸收率低。為了得到高活性人參皂苷，本論文針對(duì)人參三醇類皂苷的生物轉(zhuǎn)化，研究了人參皂苷酶 IV型的微生物發(fā)酵產(chǎn)酶、酶的分離純化和酶的催化特性以及酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)品的制備。
　　以三七根為原料，用甲醇浸提法提取了總皂苷，醇提物經(jīng)脫脂、水飽和正丁醇萃取、硅膠層析分離后，制備了高純度的三醇類皂苷Rg1和R1。Rg1純度為98.4％，得率為3.17%；R1純度為9

2、6.7%，得率為0.48%；為本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備了酶反應(yīng)底物。
　　篩選了產(chǎn)人參三醇類皂苷糖苷酶效果較好的Aspergillus sp.39g菌。該菌最佳發(fā)酵產(chǎn)酶條件是：以含1%的人參水提物（誘導(dǎo)物）的5%麥芽汁為培養(yǎng)基，在30℃發(fā)酵4天。對(duì)其培養(yǎng)液去除菌體、濃縮后，用DEAE離子交換層析法和凝膠電泳法分離純化，得到純酶。用SDS-PAGE法測(cè)得酶的分子量為約56kDa。酶反應(yīng)最適pH為6.0，最適溫度為40℃；在pH3.0-7.0的范圍

3、內(nèi)、60℃以下穩(wěn)定。K+、Na+、Zn2+和Ca2+4種離子對(duì)酶的活力幾乎沒(méi)有影響，而Mg2+離子對(duì)酶活力有微弱的促進(jìn)作用，Cu2+和Fe2+抑制酶活力。
　　提純的酶能水解多種三醇類皂苷6-O-上的多種糖基，即它能水解Re上的6-O-α-L-(1→2)-鼠李糖基、R1上的6-O-β-D-(1→2)-木糖基生成Rg1，然后進(jìn)一步水解Rg1上的6-O-β-D-葡萄糖基，生成F1；能水解Rg2(S)上的6-O-α-L-(1→2)-鼠李

4、糖基、Rf(S)上的6-O-β-D-(1→2)-葡萄糖基，生成Rh1(S)，然后進(jìn)一步水解Rh1(S)上的6-O-β-D-葡萄糖苷鍵，生成苷元；但是不能水解二醇類皂苷例如Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、F2上3-O-或20-O-上的糖基，不能水解多數(shù)糖苷酶底物對(duì)硝基苯基的多種糖基，但能水解對(duì)硝基苯基-β-D-半乳糖苷（pNP-β-D-Gal）。該酶能水解多種三醇類皂苷6-O-上的多種糖基，不同于國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)公布的184種糖

5、苷酶（http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/，一種糖苷酶只能水解一種糖苷鍵），是新型酶；也不同于水解人參二醇類皂苷的3-O-和20-O-多種糖基的人參皂苷酶I型、II和III型，將其命名為人參皂苷糖苷酶IV型。
　　研究了人參皂苷酶IV型水解各三醇皂苷底物的動(dòng)力學(xué)。Re與R1結(jié)構(gòu)相似，苷元相同，含三個(gè)糖基，只是6-O-的糖基不同，Re的6-O-糖鏈末端糖基為鼠李糖，而R1的6-O-糖鏈末端糖基為木糖；酶

6、水解Re鼠李糖基的Km=22.2 mM，Vmax=7.94mM/h,水解R1木糖基的Km=7.06mM，Vmax=1.61mM/h；在5mM濃度時(shí)，水解Re的鼠李糖基速度為1.46mM/h，水解R1的木糖基速度為0.67mM/h；因此該酶水解Re的鼠李糖基速度高于水解R1的木糖基速度。Rg1在20-O-和6-O-上各連有一個(gè)葡萄糖基，酶水解Rg1上6-O-葡萄糖基的Km=7.63mM，Vmax=0.125mM/h,在5mM的水解速度為0

7、.05mM/h，說(shuō)明該酶水解苷元上的6-O-葡萄糖基速度很慢。Rg2(S)與Rf(S)結(jié)構(gòu)相似，與Re和R1的不同點(diǎn)為20-O-上沒(méi)有糖基；Rg2(S)的6-O-糖鏈末端糖基為鼠李糖，而Rf(S)的6-O-糖鏈末端糖基為葡萄糖；酶水解Rg2(S)上6-O-α-L-(1→2)-鼠李糖基的Km=5.74mM，Vmax=9.43mM/h,水解Rf(S)上6-O-α-L-(1→2)-葡萄糖基的Km=5.74mM，Vmax=9.43mM/h，在5

8、mM濃度時(shí)，水解Rg2(S)的速度為1.26mM/h，水解Rf(S)的速度為0.98mM/h；該酶更容易水解鼠李糖基?？傊?，人參皂苷酶IV型水解糖基的速度為：Re上的鼠李糖基＞Rg2(S)上的鼠李糖基＞Rf(S)上的葡糖糖基＞R1上的木糖基＞Rg1上直接連在苷元上的葡萄糖基。
　　用人參皂苷糖苷酶IV型轉(zhuǎn)化人參三醇皂苷Re和Rg1的混合物制備高活性F1單體皂苷。在pH6.0、40℃、底物反應(yīng)濃度2.5%的條件下，反應(yīng)24h，回收酶