菜青蟲中腸響應(yīng)CoTI的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.pdf

1、菜青蟲(Pieris rapae L)屬鱗翅目粉蝶科昆蟲，是十字花科蔬菜的主要蟲害之一。菜青蟲利用消化道蛋白酶降解食物蛋白質(zhì)以獲得其生長發(fā)育必需的氨基酸，并利用細(xì)胞色素P450等解毒酶降解宿主植物來源的抗蟲次生代謝物。本研究前期研究結(jié)果表明，來自菜青蟲非宿主植物決明（Cassia obtusifolia）的胰蛋白酶抑制劑(CoTI)對(duì)菜青蟲有較強(qiáng)的抗性。本文利用分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)錄組測序等技術(shù)分析喂食CoTI前后，菜青蟲中腸消化酶等的轉(zhuǎn)錄水

2、平變化，為研究CoTI的抗蟲機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　本文首先將CoTI基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a中，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET28a/CoTI，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定及測序分析，表明該重組質(zhì)粒含有目的基因片段，且構(gòu)建正確，表達(dá)純化蛋白并檢測濃度為920μg/ml。
　　隨后對(duì)菜青蟲喂食含有CoTI的白菜葉，以喂食正常白菜葉的菜青蟲為對(duì)照，分別提取中腸總RNA，利用Illumina4000測序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序共獲得了菜

3、青蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)17.16Gb，分別獲得28，918，396和28，678，331條高質(zhì)量的reads。通過Trinity軟件組裝共獲得51，544個(gè)Unigenes。將這些Unigenes序列與公共數(shù)據(jù)庫Nr、Swiss-Prot、GO、KOG、COG和KEGG等進(jìn)行比對(duì)注釋，共有22，233條Unigenes獲得功能注釋。通過比對(duì)Nr數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了相關(guān)的消化酶與解毒酶家族，105個(gè)絲氨酸蛋白酶（79個(gè)胰蛋白酶和26個(gè)糜蛋白酶，PrSPs

4、），74個(gè)脂肪酶(PrLPs)，17個(gè)淀粉酶(PrALs)，113個(gè)細(xì)胞色素P450(PrCYP450s)，46個(gè)羧酸酯酶（PrCXs），54個(gè)UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶(PrUGTs)和41個(gè)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(PrGSTs)。
　　比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組菜青蟲中腸的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)有3，066個(gè)差異表達(dá)基因，并對(duì)它們進(jìn)行GO分析，COG分析與KEGG通路分析等。通過分析KEGG通路發(fā)現(xiàn)，參與生長和發(fā)育信號(hào)通路的幾個(gè)關(guān)鍵基因wnt、Hipp

5、o和Notch在不同的處理?xiàng)l件下表達(dá)有所差異，這表明CoTI可能抑制了菜青蟲獲得正常的生長和發(fā)育的能力。
　　對(duì)菜青蟲進(jìn)行qRT-PCR內(nèi)參基因選擇。先從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選8個(gè)比較穩(wěn)定的Unigene，包括Sec61、PSMD9、eIF2g、UPF3、LRE、NADH、hnRNP、THOC2作為候選內(nèi)參基因，然后選擇RPL32、EF1、GADPH等3個(gè)常用的內(nèi)參基因一起作為候選內(nèi)參基因，分析它們在菜青蟲不同組織，不同發(fā)育階段與不同