多酚氧化酶抑制劑對(duì)菜青蟲(chóng)的防效及其毒理學(xué)研究.pdf

1、昆蟲(chóng)多酚氧化酶(EC.1.14.18.1，Phenoloxidase，簡(jiǎn)稱PPO)，又稱酚氧化酶，酪氨酸酶，是昆蟲(chóng)體內(nèi)酪氨酸代謝的關(guān)鍵酶，與黑色素的形成、昆蟲(chóng)蛹化、蛻皮時(shí)的鞣化、表皮硬化等直接相關(guān)，通過(guò)抑制害蟲(chóng)的多酚氧化酶活力將影響其幼蟲(chóng)的發(fā)育。該酶可以作為新型農(nóng)藥的作用靶標(biāo)，而該酶的抑制劑則可發(fā)展成為具有應(yīng)用前景的新型的病蟲(chóng)害殺蟲(chóng)劑。在本研究中我們以農(nóng)作物重要鱗翅目害蟲(chóng)菜青蟲(chóng)的多酚氧化酶作為研究對(duì)象，檢測(cè)合成的縮氨基硫脲化合物對(duì)其活力

2、的影響，并在此基礎(chǔ)上合成多種結(jié)構(gòu)的縮氨基硫脲和3，4-二羥基苯甲酸酯類(lèi)化合物，進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)菜青蟲(chóng)多酚氧化酶抑制作用及殺蟲(chóng)效能。同時(shí)克隆菜青蟲(chóng)的多酚氧化酶基因，研究效應(yīng)物對(duì)該基因表達(dá)的影響。這對(duì)于多酚氧化酶劑制劑在農(nóng)藥上的應(yīng)用具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.用苯甲醛縮氨基硫脲類(lèi)化合物作為抑制劑，研究其對(duì)菜青蟲(chóng)酚氧化酶的抑制動(dòng)力學(xué)。結(jié)果表明，合成的四種苯甲醛縮氨基硫脲類(lèi)化合物對(duì)菜青蟲(chóng)酚氧化酶抑制作用

3、的IC50分別為0.5、0.6、4和10μmol/L；其動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果表明：這四種化合物均為可逆的混合型抑制劑，其抑制常數(shù)(K1)分別為0.059、0.047、0.033和0.036 mmol/L。這為進(jìn)一步設(shè)計(jì)新的高生物活性、低毒、副作用小的酚氧化酶抑制劑提供了一定的參考依據(jù)，因而合成的化合物在農(nóng)業(yè)殺蟲(chóng)劑領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 2.采用乙醇與水作為溶劑，冰醋酸作為催化劑，在加熱回流的條件下成功的合成了7種縮氨基硫脲類(lèi)化

4、合物，并采用質(zhì)譜和核磁共振對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。選擇了糠醛縮氨基硫脲(A1)、對(duì)氰基苯甲醛縮氨基硫脲(A2)、對(duì)氯苯甲醛縮氨基硫脲(A3)、4-甲氧基肉桂醛縮氨基硫脲(A4)、2，4-二羥基苯甲醛縮氨基硫脲(A5)、3，4-二羥基苯甲醛縮氨基硫脲(A6)、3-溴-4-羥基-5-甲氧基苯甲醛縮氨基硫脲(A7)作為效應(yīng)物，研究了它們對(duì)菜青蟲(chóng)酚氧化酶粗提液活力的影響，研究表明，效應(yīng)物都對(duì)菜青蟲(chóng)多酚氧化酶有良好的抑制效應(yīng)，由于其苯環(huán)上的取代基與取代

5、位置不同，其抑制效應(yīng)也有差異。
　　 3.采用EDC·HCl催化縮合的方法合成3，4-二羥基苯甲酸酯類(lèi)化合物，對(duì)菜青蟲(chóng)藥效的預(yù)試驗(yàn)表明，3，4-二羥基苯甲酸酯類(lèi)隨著疏水鏈的增長(zhǎng)，殺蟲(chóng)能力提高。對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用和對(duì)小菜蛾(Plutella xylostella L.)的毒效試驗(yàn)結(jié)果表明，3，4-二羥基苯甲酸己酯對(duì)酪氨酸酶的IC50為0.9 mmol/L，3，4-二羥基苯甲酸庚酯的IC50為0.26mmol/L；在對(duì)小菜蛾的

6、殺蟲(chóng)毒力上，3，4-二羥基苯甲酸庚酯的毒力倍數(shù)是3，4-二羥基苯甲酸己酯的1.98倍。說(shuō)明隨著碳鏈的延長(zhǎng)，對(duì)酶的抑制作用和殺蟲(chóng)能力都增強(qiáng)，因此可推測(cè)3，4-二羥基苯甲酸己酯和3，4-二羥基苯甲酸庚酯抑制了多酚氧化酶的活性，從而影響了小菜蛾幼蟲(chóng)的蛻皮，使小菜蛾的發(fā)育受阻，進(jìn)而出現(xiàn)一定的死亡率。3，4-二羥基苯甲酸庚酯與3，4-二羥基苯甲酸己酯相比只是在苯環(huán)的長(zhǎng)側(cè)鏈延長(zhǎng)了一個(gè)CH2基團(tuán)，能更好的與酚氧化酶的結(jié)合，加強(qiáng)了對(duì)酚氧化酶的抑制作用。

7、
　　 4.PPO(prophenoloxidase)是無(wú)活性的酶原，通過(guò)蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活形成PO。為了研究多酚氧化酶抑制劑對(duì)菜青蟲(chóng)多酚氧化酶基因表達(dá)的影響，我們克隆了來(lái)自菜青蟲(chóng)(鱗翅目：粉蝶科)五齡幼蟲(chóng)的PPO1和PPO2的cDNA全長(zhǎng)序列。PrPPO1的cDNA全長(zhǎng)為3307 bp，編碼蛋白由682個(gè)氨基酸組成，分子量為78532 Da，PI為6.18；PrPPO2的cDNA全長(zhǎng)為2384bp，編碼蛋白由691個(gè)氨基酸組成，

8、分子量為79059Da，PI為5.98。PrPPO1和PrPPO2氨基酸序列的生物信息學(xué)分析表明：N-末端均缺乏信號(hào)肽，含有一個(gè)保守的蛋白裂解位點(diǎn)(RF)和一個(gè)硫醇脂位點(diǎn)(CGCGWPQ/RHML)。此外，都含有可能的N-糖基化位點(diǎn)，但只有PrPPO2有O-糖基化位點(diǎn)。BLASTp表明PrPPO1的氨基酸序列與其他鱗翅目PPO1氨基酸序列相似性為71-74％；PrPPO2的氨基酸序列與其他鱗翅目PPO2氨基酸序列相似性為70-75％。<

9、br>　　 5.菜青蟲(chóng)PPO基因主要由PPO1和PPO2兩種基因組成。兩步法RT-PCR能精確而又準(zhǔn)確的對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析，通過(guò)相對(duì)定量RT-PCR分析PrPPO1和PrPPO2兩個(gè)基因在菜青蟲(chóng)組織中的表達(dá)差異性，結(jié)果表明：PrPPO1和PrPPO2基因在菜青蟲(chóng)五齡幼蟲(chóng)的血淋巴、表皮、中腸和頭中均有表達(dá)，兩個(gè)基因在血淋巴中的表達(dá)量最高，在中腸的表達(dá)量最低。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明PrPPO1與小菜蛾的親緣關(guān)系最近，PrPPO2與云杉卷葉