禽多殺性巴氏桿菌耐藥株的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析.pdf

1、禽多殺性巴氏桿菌是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的病原菌，能夠引起家禽和野生鳥類禽霍亂。近年來由于養(yǎng)殖業(yè)的廣泛且不合理的使用抗菌藥物，禽多殺性巴氏桿菌的多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致患病家禽大批死亡，給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，開展禽多殺性巴氏桿菌的耐藥機(jī)制，尋找藥物作用新靶點(diǎn)的研究具有重要意義。
　　諸多研究表明禽多殺性巴氏桿菌臨床分離株多呈現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類、四環(huán)素類、磺胺類和氟喹諾酮類等抗菌藥物的多重耐藥性，并且認(rèn)為其耐藥性的產(chǎn)生主要是

2、由耐藥質(zhì)粒和藥物作用靶位改變所導(dǎo)致，但是其確切的分子耐藥機(jī)制尚不清楚。對(duì)此，本研究在人工體外誘導(dǎo)耐藥菌株的基礎(chǔ)上，從轉(zhuǎn)錄組層面進(jìn)行禽多殺性巴氏桿菌對(duì)鏈霉素、環(huán)丙沙星和四環(huán)素的分子耐藥機(jī)制初步探討。主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下:
　　首先，禽多殺性巴氏桿菌耐藥菌株的體外誘導(dǎo)及其特性檢測(cè)。將禽多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株C48-1接種含有1/2MIC相應(yīng)抗生素的TSA培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)至25代后，成功獲得了高度耐藥的StrR菌株以及中度耐藥的CipR

3、和TetR菌株。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，耐藥菌株的生長(zhǎng)速率和生理生化特性未發(fā)生明顯改變，對(duì)多種抗菌藥物的敏感度降低甚至轉(zhuǎn)為耐藥，并且在無抗性培養(yǎng)基中連續(xù)傳代20代后仍具有穩(wěn)定的耐藥性。這些穩(wěn)定的耐藥菌株可用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。
　　其次，耐藥菌株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與生物信息學(xué)分析。提取標(biāo)準(zhǔn)菌株與耐藥菌株總RNA進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序，比較分析細(xì)菌誘導(dǎo)耐藥前后基因表達(dá)的變化，并通過GO、KEGG和ARDB分析，探討差異表達(dá)基因的功能及其涉及的代謝通路。

4、結(jié)果顯示:與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，SrtrR菌株有625個(gè)差異表達(dá)基因，其中584個(gè)上調(diào)表達(dá)，41個(gè)下調(diào)表達(dá)。這些差異基因涉及11類分子功能、參與19個(gè)生物過程和84個(gè)代謝通路，經(jīng)ARDB檢索出主要為氨基糖苷轉(zhuǎn)移酶類和外排泵類的9種耐藥相關(guān)基因。TetR菌株有442個(gè)差異表達(dá)基因，其中103個(gè)上調(diào)表達(dá)，339個(gè)下調(diào)表達(dá)，其涉及12類分子功能、參與18個(gè)生物過程和90個(gè)代謝通路，經(jīng)ARDB檢索出主要為核糖體保護(hù)蛋白和外排泵類的4種耐藥相關(guān)基因。C

5、ipR菌株有19個(gè)差異表達(dá)基因，其中15個(gè)上調(diào)表達(dá)，4個(gè)下調(diào)表達(dá)。這些差異基因涉及3類分子功能、參與8個(gè)生物過程和6個(gè)代謝通路，未檢索出耐藥相關(guān)基因。
　　最后，差異表達(dá)基因的熒光定量PCR驗(yàn)證。從三組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中挑選10個(gè)差異表達(dá)基因，以16S rRNA為內(nèi)參基因，系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)菌株cDNA為模板，通過SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)各基因的熔解曲線、擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，各基因的熔解曲線峰形單一，反

6、應(yīng)特異性好，擴(kuò)增曲線重復(fù)性較好，內(nèi)參基因與各目的基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99，擴(kuò)增效率E均在0.9-1.0之間且E值相差小于5％，CT值均在10-35以內(nèi)，適合采用2-ΔΔCt法對(duì)差異基因進(jìn)行mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)。以適當(dāng)稀釋的檢測(cè)樣品為起始模板濃度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，根據(jù)2-ΔΔCt法分析各基因的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)三組差異基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。
　　綜上所述，本研究獲得了3株穩(wěn)定的耐藥菌株(Te