超聲分子影像顯像胰島移植IBMIR.pdf

1、背景:
　　 IBMIR是以凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)激活,中性粒單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征的級(jí)聯(lián)反應(yīng),導(dǎo)致胰島被破壞。其發(fā)生以血小板活化為放大劑,為我們從凝血系統(tǒng)活化角度識(shí)別IBMIR發(fā)生程度和范圍提供了理論依據(jù)。分子影像學(xué)的發(fā)展,使得影像學(xué)從觀察大體解剖變化向觀察微觀分子水平的復(fù)雜病理學(xué)變化方面轉(zhuǎn)變。超聲的靈敏度極高,具有成像簡(jiǎn)便、快速、實(shí)時(shí)、可重復(fù)等優(yōu)點(diǎn),為我們采用超聲分子影像技術(shù)顯示IBMIR發(fā)生提供了可能。
　　 目的:

2、>　　 通過(guò)制備靶向結(jié)合活化血小板的靶向超聲造影劑,建立體內(nèi)外IBMIR模型,采用超聲造影及其強(qiáng)度定量分析軟件評(píng)價(jià)靶向超聲造影劑顯示胰島移植IBMIR的能力和效果,實(shí)現(xiàn)胰島移植IBMIR的超聲分子成像特異性顯像。
　　 方法:
　　 一、血栓靶向脂質(zhì)超聲造影劑的制備與鑒定
　　 首先合成熒光標(biāo)記的能與血小板糖蛋白GPⅡ b/Ⅲa受體特異性結(jié)合的KGDS-棕櫚酸化合物。采用“超聲勻化+高速機(jī)械剪切”法,以FITC

3、-KGDS-Palm為主要原料之一,制備靶向脂質(zhì)超聲造影劑。顯微鏡觀察靶向微泡的形態(tài)及分布;馬爾文顆粒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)微泡大小、濃度及分布;熒光顯微鏡觀察KGDS多肽與微泡結(jié)合情況;流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)多肽與微泡的結(jié)合效率;觀察靶向微泡在體內(nèi)外的穩(wěn)定性;采用體內(nèi)外血栓模型,檢測(cè)靶向微泡與血栓特異性結(jié)合的能力。
　　 二、體外IBMIR模型的建立
　　 將500 IEQ和1000 IEQ新生豬胰島分別與實(shí)驗(yàn)組人的7ml新鮮全血混合加入

4、肝素化的管道,使Loops管內(nèi)新鮮血液中肝素的最終濃度分別為0.001mg/ml、0.01 mg/ml、0.02 mg/ml。Loops管固定于鐘擺式無(wú)級(jí)調(diào)節(jié)溫控?fù)u床中搖擺5分鐘、10分鐘、60分鐘,模擬血液在體內(nèi)血管的流動(dòng)。空白組健康人新鮮全血抽出后立即作檢測(cè),對(duì)照組健康人新鮮全血7ml+100μl培養(yǎng)液,搖擺60min。檢測(cè)血液中BR、C3a、C5b-9、ATA、β-TG等的變化,稱(chēng)重凝血塊的重量并對(duì)其行病理學(xué)檢測(cè)。
　　

5、三、體外IBMIR的超聲分子成像
　　 體外IBMIR模型(7ml新鮮全血+1000IEQ新生豬胰島)超聲分子成像實(shí)驗(yàn)分為三組,均重復(fù)3次:A組為對(duì)照組,不加造影劑;B組為普通超聲造影劑組;C組為靶向超聲造影劑組。將上述各組Loops管道固定于搖床搖桿上,并浸于37℃的水浴槽中。采用超聲造影模式實(shí)時(shí)觀察Loops管內(nèi)的回聲,記錄超聲發(fā)現(xiàn)血栓出現(xiàn)的時(shí)間,并采用Line成像模式存儲(chǔ)在硬盤(pán),脫機(jī)分析。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后10min、30min、

6、60min,分別將Loops管內(nèi)血液經(jīng)70μm過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾,其中過(guò)濾液行實(shí)驗(yàn)室凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)及胰島素含量檢測(cè),血栓部分行病理學(xué)檢測(cè)。
　　 四、體內(nèi)IBMIR的超聲分子成像
　　 采用雄性SD大鼠(體重300±g)40只,3％戊巴比妥鈉腹腔麻醉,仰臥位捆綁固定;褪毛劑備皮腹部:腹中線切口約4cm,24G靜脈留置針穿刺并固定于腸系膜上靜脈,移植物經(jīng)此途徑移植入肝臟門(mén)靜脈系;采用4.5號(hào)頭皮針穿刺并固定于陰莖背靜脈,采用團(tuán)

7、注法將0.4ml/kg超聲造影劑注入體內(nèi)。隨機(jī)分配實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,各組均為5只,具體如下:A組為空白對(duì)照組,注射靶向超聲造影劑,不移植胰島:B組為普通造影劑對(duì)照組,注射普通超聲造影劑,移植胰島;C組為靶向造影劑微囊對(duì)照組,注射靶向超聲造影劑,移植海藻酸鈉微囊;D組為靶向造影劑實(shí)驗(yàn)組,注射靶向超聲造影劑,移植胰島,D組按移植胰島后0、5、15、30、60分鐘等再分為五個(gè)小組,即D0、D5、D15、D30、D60。
　　 實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察肝臟

8、增強(qiáng)情況;于注射造影劑后5min、15min、30min、60min采集肝臟的左、中、右三個(gè)斷面的圖像,采用Line模式儲(chǔ)存于超聲儀硬盤(pán),脫機(jī)分析。
　　 以上A、B、C各組,均于造影后30min,尾靜脈檢測(cè)血糖水平,采集腹主動(dòng)脈血液行凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)、C肽等水平檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)完畢,處死動(dòng)物取肝臟組織10％福爾馬林固定,行病理學(xué)檢測(cè)。其中D組的D0、D5、D15、D30、D60小組,分別于造影后0min、5min、15min、30

9、min、60min采集血液及處死動(dòng)物,取肝臟組織作病理學(xué)檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 一、血栓靶向超聲造影劑的制備與鑒定
　　 KGDS-TUCA靶向超聲造影劑呈淡黃色混懸液,微泡濃度約為1.5×109/ml,平均粒徑為1.5±0.2μm,98％微泡小于5μm。熒光顯微鏡顯示靶向超聲造影劑表面呈明亮的綠色熒光;流式細(xì)胞儀檢測(cè)KGDS結(jié)合效率為90.04％;體外4℃保存48h,微泡濃度及粒徑無(wú)顯著性改變;體內(nèi)團(tuán)注靶向

10、超聲造影劑肝臟平均灰階值達(dá)109.98±18.01,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)約15分鐘:體外靶向及其拮抗實(shí)驗(yàn),證實(shí)靶向超聲造影劑與血栓特異性結(jié)合;體內(nèi)下腔靜脈夾閉法建立血栓模型,采用靶向超聲造影劑可以增強(qiáng)下腔靜脈內(nèi)血栓。
　　 二、體外IBMIR模型的建立
　　 Tubing Loops內(nèi)肝素濃度為0.001mg/ml時(shí)對(duì)新鮮全血的正常生理功能影響最小,可以長(zhǎng)時(shí)間模擬體內(nèi)血液生理功能不變。血液樣本加入新生豬胰島以后,1000IEQ實(shí)驗(yàn)

11、組于10min開(kāi)始出現(xiàn)了血凝塊,隨時(shí)間的延長(zhǎng),凝血塊逐漸增大。Tubing Loops管中血液的血小板數(shù)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而減少,β-TG、TAT顯著增加;血漿中C3a、C5b-9的增加;淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞被大量消耗;血凝塊病理學(xué)檢測(cè)顯示,胰島細(xì)胞周?chē)谎ò鼑?其周邊及血栓內(nèi)均可見(jiàn)中性白細(xì)胞浸潤(rùn),胰島移植物表面包膜被破壞,出現(xiàn)裂解征象。
　　 三、體外IBMIR的超聲分子成像
　　 體外Loops管內(nèi)加入的造影劑的劑量以0.

12、04ml為佳。A組沒(méi)有加入造影劑,不能發(fā)現(xiàn)血栓形成;B組加入自制普通超聲造影劑,Loops管內(nèi)可以顯示血栓,血栓周邊及內(nèi)部無(wú)增強(qiáng),呈充盈缺損改變,發(fā)現(xiàn)血栓需要時(shí)間約為7.3±0.5min,超聲平均灰階值31.22±3.56;C組加入靶向超聲造影劑,Loops管內(nèi)可以清晰顯示環(huán)狀增強(qiáng)的血栓,發(fā)現(xiàn)血栓需要時(shí)間約為13.2±0.6min,超聲平均灰階值(level)為75.85±5.21。B組、C組血栓平均灰階值及發(fā)現(xiàn)時(shí)間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

13、血液學(xué)檢測(cè)顯示實(shí)驗(yàn)各組均發(fā)生了IBMIR,即凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)活化,血液胰島素含量升高。病理檢測(cè)顯示,胰島與新鮮全血接觸后,其表面形成血栓殼,加入帶熒光的靶向超聲造影劑,熒光顯微鏡可以清楚觀察到胰島周邊呈明亮的熒光光環(huán),與血栓殼位置、形態(tài)、范圍完全吻合。
　　 四、體內(nèi)IBMRI的超聲分子成像
　　 1.各組肝臟超聲增強(qiáng)動(dòng)態(tài)變化:團(tuán)注超聲造影劑后,A組、B組、C組、D組于注射造影劑9秒后肝臟開(kāi)始增強(qiáng),A組、B組、C組造影

14、劑約于造影后2分鐘開(kāi)始從肝臟廓清,15分鐘后基本廓清,30分鐘后完全廓清,肝臟內(nèi)未見(jiàn)增強(qiáng)聲像;D組造影劑也約于造影后2分鐘開(kāi)始從肝臟廓清,但15分鐘后肝臟內(nèi)可見(jiàn)密集星點(diǎn)狀增強(qiáng),持續(xù)監(jiān)測(cè)1h沒(méi)有消退;
　　 2.各組肝臟超聲增強(qiáng)定量分析:造影前,各組肝臟平均灰階值,約為7左右,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;造影10min后,D組平均灰階值為52.22±6.73,明顯高于A組、B組、C組的平均灰階值(P<0.05);造影30分鐘后,A組、B組、

15、C組、D組平均灰階值均降低,A組、B組、C組與造影前相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而D組平均灰階值明顯高于造影前強(qiáng)度。
　　 3.血液學(xué)檢測(cè)結(jié)果:A組、C組沒(méi)有移植微囊,其血液ATA、D-dimer、C3a、C5b-9、血糖等均沒(méi)有變化;B組、D組移植胰島30 min后,血液ATA、D-dimer、C3a、C5b-9明顯升高,血糖下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);D組內(nèi)各小組血液學(xué)指標(biāo)顯示ATA于15min,C3a、C5b-9含量

16、于5min時(shí)達(dá)最高水平,分別為82±10.5μg/ml、45±4.6ng/ml、116±9.5 ng/ml,之后隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低,30 min時(shí)分別為41.2±4.7μgt/ml、11.7±5.3 ng/ml、29.6±8.3ng/ml,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而D-dimer則隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.本研究采用“超聲勻化+高速機(jī)械剪切法”,首先合成KGDS-Palm化合物,以之為主

17、要原料,制備出靶向超聲造影劑,其合成方法簡(jiǎn)單,制備過(guò)程中不需添加造影劑原料以外的材料,利于靶向造影劑的制備及純化;配體KGDS結(jié)合率高,達(dá)90.04％;KGDS-TUCA靶向超聲造影劑體內(nèi)外穩(wěn)定性好、靶向結(jié)合特異性強(qiáng)。
　　 2.胰島與新鮮全血接觸后,激活凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng),血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞大量消耗,胰島形態(tài)完整性被破壞,發(fā)生IBMIR.反應(yīng)。采用1000IEQ新生豬胰島加至肝素終濃度為0.001mg/ml的含7ml

18、健康人新鮮全血的體外循環(huán)管道,固定于鐘擺式搖床中可以建立穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)化的IBMIR體外模型。
　　 3.體外胰島移植IBMIR模型,KGDS-TUCA靶向超聲造影劑可以靶向結(jié)合于胰島表面血栓殼,能有效顯示IBMIR的發(fā)生及其范圍、程度。
　　 4.肝內(nèi)移植胰島,激活凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng);機(jī)體為維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性,相應(yīng)的纖溶系統(tǒng)、補(bǔ)體調(diào)節(jié)系統(tǒng)被激活,凝血系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)活化受到對(duì)抗。注入KGDS-TUCA靶向超聲造影劑,可以特異