凝血酶抑制劑—阿加曲班抑制胰島移植后IBMIR的研究.pdf

1、糖尿病是常見的內(nèi)分泌代謝疾病，其引發(fā)的多種并發(fā)癥嚴重危害人們的身心健康，只有建立內(nèi)源性胰島素分泌系統(tǒng)才能根治糖尿病。目前主要有胰腺移植和胰島移植兩種方法能達到此治療目的。胰島移植屬于細胞移植范疇，雖然目前胰島移植對外源性胰島素依賴性的解除不如胰腺移植高，但與胰腺移植相比具有安全、簡便、利于體外移植物修飾、不良反應較低和可重復性等優(yōu)點，已成為很有發(fā)展前景的方法。 盡管胰島移植在治療1型和部分2型糖尿病有其獨特的優(yōu)勢，但其遠期療效不

2、夠理想，其主要原因包括(1)供體胰島的分離和純化技術尚不完善，無法獲得數(shù)量及質(zhì)量都上乘的胰島細胞， (2)免疫排斥反應， (3)胰島缺血缺氧損傷，(4)胰島移植早期即刻經(jīng)血液介導的炎性反應(IBMIR)。 目前研究表明，胰島移植早期常伴有大量胰島的丟失，這種現(xiàn)象被統(tǒng)稱為原發(fā)性無功能，而與免疫因素無關。除了胰島制備中內(nèi)在的固有質(zhì)量因素外，另外的一個重要原因就是新植入的胰島與血流接觸后所引發(fā)的反應，被稱為立即經(jīng)血液介導的炎癥(Ins

3、tant blood mediated inflammatory reaction以下簡稱IBMIR)，其反應特征是血小板的激活和凝血系統(tǒng)以及補體系統(tǒng)的激活，這些瀑布反應導致胰島的損傷。當胰島細胞與ABO血型相容性的血液相互接觸之后，5 min即出現(xiàn)凝血現(xiàn)象。血小板與胰島表面迅速的結合并導致血液中血小板的迅速減少，緊接著是纖維蛋白形成并圍繞在胰島的表面以及大量炎性細胞浸潤和補體的活化，接著就出現(xiàn)血液凝固，從而引起胰島細胞的破壞。綜上所述

4、，這些反應也都是由血小板的活化和凝血反應所引起的。因此尋找一種有效的抑制血小板活化和凝血反應的方法將可以阻止IBMIR的發(fā)生，從而減少移植早期胰島的破壞。 研究表明，凝血酶是一種絲氨酸蛋白酶，由凝血酶原轉(zhuǎn)換而來，它不但是凝血反應中起關鍵作用的酶，而且是一種有效的血小板活化劑，它通過與血小板表面的PAR-1和PAR-4結合激活血小板，因此凝血酶抑制劑將會有效的抑制凝血的發(fā)生和血小板的活化，從而抑制IBMIR。本實驗通過應用體外模擬

5、血管模型構建IBMIR模型并通過加入凝血酶抑制劑(阿加曲班)研究其對胰島移植早期IBMIR的抑制作用。 材料與方法： 實驗動物：普通級封閉群Wistar大鼠，雌雄不限，重量250-300g(購自中國醫(yī)科大學實驗動物部)。實驗分組：空白對照組即經(jīng)60min循環(huán)反應無胰島細胞組(2mlblood+RPMI-1640 150μl)，對照組即經(jīng)60min循環(huán)反應含胰島組(2mlblood+RPMI-1640 150μl+800當

6、量胰島)，實驗組即(2mlblood+RPMI-1640 150μl+阿加曲班1ml+800當量胰島)。 胰島提?。合蚬┦笠裙軆?nèi)原位逆行灌注膠原酶溶液(用冷的Hank's液配制，劑量為1.5mg/ml)10-12ml，使胰腺充分膨脹。切取后在37±1℃水浴中振蕩消化，消化時間12-15 min。終止消化后，兩次離心洗滌，過80目篩。Ficoll梯度離心法純化胰島，濃度分別為25％、23％、20.5％和11％，離心后于23％和20

7、.5％之間，及20.5％和11％之間交界處吸取胰島細胞，RPMI-1640洗滌兩次備用。獲取的胰島用雙硫腙染色來判斷所提胰島的純度，胰島細胞數(shù)=3次樣品中DTZ陽性細胞團數(shù)÷3×20×樣本總量(ml)。丫啶橙/溴乙啶(AO/EB)熒光染色法顯示細胞活率，體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗檢測胰島活性。 肝素化處理：將所有與大鼠血液相接觸的管道內(nèi)表面均涂以肝素，所用肝素濃度為0.5μg/cm2,相當于0.1unit/cm2。

8、血液制備：新鮮的大鼠血液被收集于肝素化的20ml的注射器中。 體外模擬循環(huán)模型建立：該模型由長度為390mm，直徑為6.3mm聚乙烯管構成，管的內(nèi)表面涂以固定化的肝素，將循環(huán)管的兩端通過肝素化的三腔接頭連接，將循環(huán)管固定于擺動器上，并放入37℃溫箱中，通過擺動模擬體內(nèi)血液循環(huán)。 反應后指標檢測：將反應后的胰島行葡萄糖下胰島素刺激試驗，評價胰島功能。大鼠血液經(jīng)血常規(guī)檢查，計數(shù)血小板，白細胞，淋巴細胞，單核細胞數(shù)。

9、組織形態(tài)學檢測：反應后過濾血液，將組織塊行TCT檢測，觀察胰島形態(tài)變化及周圍包繞細胞類型。 統(tǒng)計學分析：將所得數(shù)據(jù)用均值土標準差表示。t檢驗進行處理，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.胰島提?。浩骄恐淮笫罂色@得約500-600IEQ胰島，經(jīng)DTZ染色后，純度>90％。胰島活率>95％。體外葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗表明，新鮮胰島在低糖溶液中胰島素平均含量58.1±3.5μIU/ml，高糖溶液中胰島素平

10、均含量為195.2±12.61μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.35±0.20，說明胰島功能較好，對照組中胰島在低糖下胰島素平均含量為46.1±3.2μIU/ml，高糖下胰島素平均含量為103.2±11.8μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為2.25±0.18，說明胰島功能明顯受損，實驗組中低糖下胰島素釋放量為53.6±3.3μIU/ml，高糖下胰島素釋放量為180.2±10.8μIU/ml，釋放指數(shù)(SI)為3.36±0.18說明胰島功

11、能較好。 2.血液分析：對照組中血小板數(shù)為(n=10)38±14×109/L，實驗組中血小板數(shù)為255±85×109/L，兩組間有明顯的統(tǒng)計學差異(p<0.05)，對照組中白細胞數(shù)為4.2±0.96×109/L，實驗組中白細胞數(shù)8.1±1.19×109/L，兩組間有明顯統(tǒng)計學差異(p<0.05)，對照組中單核細胞數(shù)為(n=10)0.25±0.10×109/L，實驗組中單核細胞數(shù)為0.41±0.13×109/L，兩組間有明顯的統(tǒng)計

12、學差異(p<0.05)，對照組中淋巴細胞百分數(shù)為51.5±8.5％，實驗組中淋巴細胞百分數(shù)為66.2±9.8％，兩組間有明顯統(tǒng)計學差異(p<0.05)。 3.TCT 檢測：對照組中胰島明顯減少，被膜不完整，胰島周圍見大量紅細胞形成的微血栓，而實驗組中胰島形態(tài)較完整，數(shù)量較多，周圍無炎性細胞浸潤，也未見明顯微血栓形成。 結論： 1.IBMIR是胰島移植早期胰島損傷的主要原因。 2.應用凝血酶抑制劑阿加曲班可