TLR4在抗磷脂綜合征模型小鼠血栓形成中的作用探討.pdf

1、研究目的:
　　抗磷脂抗體(antiphospholipid antibodies，aPL)/抗β2糖蛋白Ⅰ抗體(anti-β2-glycoproteinⅠ，anti-β2GPI)在抗磷脂綜合癥(antiphospholipid syndrome，APS)發(fā)病機制中扮演重要角色。它們可以激活細胞內(nèi)信號通路，誘導促血栓、促炎癥因子的表達，最終導致血栓發(fā)生。體外細胞模型表明跨膜蛋白Toll樣受體4(Toll-likereceptor4

2、，TLR4)作為一個重要分子參與aPL/anti-β2GPI對靶細胞的識別，但目前仍缺乏足夠的體內(nèi)實驗結(jié)果支撐。本論文旨在前期研究基礎上，利用純系TLR4正常（C3H/HeN）及TLR4缺陷型(C3H/HeJ)小鼠建立實驗性APS(EAPS)小鼠模型，深入分析TLR4在aPL/anti-β2GPI誘發(fā)小鼠動靜脈血栓形成中的作用，為APS的免疫干預及血栓形成的防治提供實驗依據(jù)。
　　研究方法:
　　(1)應用Fmoc法化學合成

3、β2GPI N端35～51位氨基酸的多肽，與鑰孔血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)后免疫新西蘭大白兔制備抗血清，蛋白G純化得到針對β2GPI第1結(jié)構(gòu)域的表位特異性抗β2GPI抗體（以下簡稱anti-β2GPI），并鑒定抗體的特異性及致病性。
　　(2)分離C3H/HeN和C3HHeJ小鼠腹腔巨噬細胞于體外培養(yǎng)，運用RT-qPCR檢測anti-β2GPI/β2GPI復合物誘導的巨噬細胞TF、TNF-α、IL1β和IL6 mRNA表達，Weste

4、rn blot方法檢測細胞培養(yǎng)上清中TF、TNF-α、IL1β和IL6蛋白表達，觀察TLR4在anti-β2GPI/β2GPI誘導巨噬細胞表達TF和炎癥因子中的作用。
　　(3)建立EAPS小鼠模型，分別于0h和48h對C3HHeN和C3H/HeJ小鼠腹腔注射anti-β2GPI（100μg/每只）或APS病人來源的IgG-APS（500μg/每只），72 h后用于實驗。取兩種小鼠腹腔巨噬細胞和雙側(cè)頸動脈，超聲裂解，Xa生成法檢測

5、TF活性，免疫組化檢測股動脈內(nèi)皮細胞TF表達，免疫熒光檢查巨噬細胞表面TF、TNF-α、IL1β和IL6蛋白表達，進一步分析TLR4缺陷對TF和炎癥因子表達的影響。
　　(4)取EAPS小鼠胸主動脈，運用RT-qPCR和Western blot方法分別檢測血管壁VCAM-1、ICAM-1和E-selectin的mRNA和蛋白的表達，從而分析TLR4對anti-β2GPI和IgG-APS誘導粘附分子表達的影響。
　　(5) C

6、3H/HeN和C3H/HeJ小鼠腹腔注射anti-β2GPI（100μg/每只）建立EAPS小鼠模型，用含濃度3.5％ FeCl3的濾紙條外敷頸動脈和股靜脈誘導血栓形成，HE染色觀察血栓大小。FeCl3外敷頸動脈前，尾靜脈注射CF633標記的抗血小板CD41 Fab片段（0.25μg/每只），熒光顯微鏡觀察頸動脈血栓大小。
　　研究結(jié)果:
　　(1)所制備的anti-β2GPI具有表位特異性，可識別人源和鼠源β2GPI分子，

7、能與位于β2GPI第1結(jié)構(gòu)域的隱蔽抗原表位特異性結(jié)合且具有致病效應。
　　(2)體外培養(yǎng)的C3H/HeN小鼠腹腔巨噬細胞經(jīng)anti-β2GPI/β2GPI復合物刺激后TF、TNF-α、IL1β和IL6 mRNA和蛋白表達明顯升高，與C3H/HeJ小鼠相比差異顯著。
　　(3)在EAPS模型小鼠中，C3H/HeN小鼠的巨噬細胞和頸動脈TF活性明顯升高，巨噬細胞和內(nèi)皮細胞TF蛋白表達顯著增多，巨噬細胞表面TNF-α、IL1β和I

8、L6蛋白表達增加，與C3H/HeJ小鼠組相比差異顯著。
　　(4) C3H/HeN小鼠腹腔注射anti-β2GPI或IgG-APS后，胸主動脈粘附分子VCAM-1、ICAM-1和E-selectin mRNA和蛋白表達升高，與相同處理的C3H/HeJ小鼠相比差異顯著。
　　(5)在FeCl3誘導EAPS小鼠血栓模型中，與C3H/HeJ小鼠組相比，C3H/HeN小鼠頸動脈產(chǎn)生更大的血栓，股靜脈有更多的紅細胞堆積。
　　結(jié)

9、論:
　　(1) TLR4介導抗β2GPI抗體/β2GPI抗原(anti-β2 GPI/β2 GPI)復合物激活體外培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細胞表達TF、TNF-α、IL1β和IL6，同時參與anti-β2GPI或IgG-APS誘導的EAPS模型小鼠TF和炎癥因子表達，表明TLR4在aPL誘導的促血栓、促炎癥狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。
　　(2) TLR4參與EAPS模型小鼠胸主動脈粘附分子VCAM-1、ICAM-1和E-selecti