靶向Survivin的RNAi治療垂體腺瘤的研究.pdf

1、RNA干擾技術(shù)是目前新興且日益成熟的的基因沉默技術(shù)，目前被認為是基因工程學領(lǐng)域的非常有效的研究工具。用此技術(shù)可以高效穩(wěn)定特異地阻止目標基因的表達，從而達到較為理想的沉默效果。目前，dsRNA，特別是siRNA已被廣泛而成功地應用于諸如基因功能研究以及疾病病因與治療研究等多個領(lǐng)域。 Survivin是耶魯大學Ambrosini等于1997年發(fā)現(xiàn)的，是凋亡抑制蛋白家族新成員，具有分子量小、功能強大等特點。它是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑

2、制因子，主要分布于胚胎及分化未成熟的組織。在成人體內(nèi)除胸腺及胎盤中有微量表達外，所有分化成熟的組織，包括外周血白細胞、淋巴結(jié)、脾、胰、腎、骨骼肌、心、肝、肺、腦組織中均無表達，而在人類腫瘤中幾乎都表達。并且Survivin與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)。 本研究方法是：首先，檢測Survivin在垂體腺瘤中的蛋白表達，探討Survivin與垂體腺瘤侵襲性發(fā)生的相關(guān)性以及它們之間的內(nèi)在聯(lián)系。然后，通過設計在垂體瘤細胞中穩(wěn)定高效表達的Sur

3、vivin-siRNA質(zhì)粒載體，研究該重組載體對于垂體瘤細胞中Survivin的干擾效果，并進一步明確干擾前后垂體瘤細胞的增殖及凋亡水平變化，以期探討Survivin是否可成為未來進行垂體瘤基因治療研究的有效靶點。 第一部分 Survivin在垂體瘤中的表達及與生物學行為關(guān)系 目的: Survivin是凋亡抑制蛋白家族非常獨特的成員，其基因在腫瘤中的表達與增加腫瘤的侵襲性和降低患者的生存率關(guān)系密切。本研究目的是

4、檢測Survivin基因在垂體腺瘤中的蛋白表達，并探討Survivin與垂體腺瘤侵襲性發(fā)生的相關(guān)性以及它們之間的內(nèi)在聯(lián)系。 方法: 1．標本 回顧性隨機收集2006年7月-2008年4月期間山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科的垂體腺瘤手術(shù)標本66例，其中女性29例（年齡29-77歲，平均年齡65．3±4．3歲），男性37例（年齡34-82歲，平均年齡68．1±2．5歲）。依據(jù)MRI提示腫瘤侵犯海綿竇或有骨質(zhì)破壞，和/或術(shù)中觀察

5、腫瘤對周圍骨質(zhì)、海綿竇有/無侵犯等情況分為侵襲性組（39例）和非侵襲性組（27例）。所有病例診斷均有術(shù)后的免疫組化病理證實。 2．免疫組化染色方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（S-P）法，按標準實驗流程，檢測Survivin基因在侵襲性和非侵襲性垂體瘤中的蛋白表達。 3．結(jié)果判定標準 根據(jù)半定量免疫組織化學評價Survivin反應陽性細胞顯色強度。在高倍視野（×400）下，每張切片隨機

6、觀察5個視野的腫瘤細胞，計算200個腫瘤細胞免疫反應陽性的細胞百分比。每張切片分別有四名實驗者進行單獨評價，對于有分歧的進行重復評價，直至達到一致。 Survivin表達評估：強陽性（+++）：陽性細胞大于50％或顯色深；中度陽性（++）：陽性細胞10％至50％之間或染色略深；弱陽性（+）：陽性細胞小于10％或顯色淺；陰性（-）：無陽性細胞染色。 4．統(tǒng)計分析 用卡方檢驗進行統(tǒng)計分析。SPSS（版本13．0）統(tǒng)計

7、學軟件進行統(tǒng)計。設定p<0．05有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果: Survivin在垂體瘤中以細胞質(zhì)著色為主，僅有散在的細胞核著色。Survivin總的陽性率為69．7％（46/66）。在侵襲性垂體瘤中Survivin的陽性率為89．7％（35/39）：而在非侵襲性垂體瘤中Survivin的陽性率僅為40．7％（11/27）?？ǚ綑z驗示兩組差異有統(tǒng)計學意義（x2=14．309， P=0．0002<0．05）。另外，在免疫組化反應為

8、陽性的侵襲性垂體瘤中以強陽性和中度陽性為主（71．4％，25/35），而在非侵襲性垂體瘤中以弱陽性為主（72．7％，8/11）。 結(jié)論: 1．Survivin在垂體瘤中有高表達。 2．Survivin在侵襲性與非侵襲性垂體腺瘤中的表達有顯著性差異，因此Survivin與垂體瘤的侵襲性密切相關(guān)。 3．Survivin可以作為判斷垂體腺瘤侵襲性生長的有效指標和用做垂體瘤基因治療研究的靶點。 第二部分設

9、計并篩選針對Survivin有效的siRNA載體 目的: 設計并合成3組針對Survivin基因的siRNA質(zhì)粒載體，并篩選出其中2組有效的載體，為下一步的研究做準備。 方法: 1．設計并合成siRNA載體 本實驗運用公眾網(wǎng)站設計軟件，針對大鼠的Survivin靶基因序列，設計3組siRNA載體，分別標記為1＃，2＃，3＃；同時合成1組為陰性對照載體，標記為0＃。然后進行測序比對。結(jié)果顯示四組載體

10、被成功構(gòu)建，測序無誤。 2．轉(zhuǎn)染工具細胞株（膠質(zhì)瘤C6） 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的工具細胞（膠質(zhì)瘤C6），轉(zhuǎn)染前一天將細胞分入6-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當天按實驗設計的分組情況加入不同質(zhì)粒載體進行細胞的轉(zhuǎn)染實驗。轉(zhuǎn)染48小時后熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，觀測轉(zhuǎn)染效率。 3．檢測干擾效果，篩選有效載體。 選出轉(zhuǎn)染效率為90％左右的組，采用FQ-PCR的方法檢測目的基因的mRNA表達情況，進而判斷不同靶點的干擾效果

11、，篩選出2組有效載體。 結(jié)果: 1．在3組siRNA載體中，1＃、2＃、3＃轉(zhuǎn)染效率分別為87．4±6．2％、92．6±4．5％、75．3±11．0％；陰性對照載體0＃的轉(zhuǎn)染效率為95．0±4．2％。 2．3個靶點均有敲減效果。與陰性對照載體0＃對比，載體1＃，2＃，3＃敲減效率分別為68．4％、44．4％、22．7％。綜合轉(zhuǎn)染效率及敲減效果，1＃、2＃是最佳的靶點。 結(jié)論: 1．本部分實驗成功構(gòu)

12、建了3組特異性針對大鼠基因Survivin的siRNA載體。 2．通過該部分實驗，我們成功地從3組重組載體中篩選出高效率的靶點，為下一步選用高效率的重組載體對垂體瘤細胞GH3進行轉(zhuǎn)染提供了可靠的實驗基礎(chǔ)。 第三部分 RNAi沉默Survivin基因?qū)Υ贵w瘤細胞增殖及凋亡水平的影響 目的: 利用構(gòu)建好的特異性強、轉(zhuǎn)染率高的攜帶針對Survivin的siRNA載體1＃、2＃，研究它們介導RNA干擾對垂體瘤細胞

13、株GH3增殖和凋亡的影響及其意義。 方法: 1．分別利用siRNA載體1＃、2＃轉(zhuǎn)染垂體瘤細胞株（GH3細胞） 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細胞（即GH3細胞），轉(zhuǎn)染前一天將目的細胞分入6-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染當天按實驗設計的組別分別利用siRNA載體1＃、2＃和對照載體0＃進行垂體瘤細胞的轉(zhuǎn)染實驗。 2．用G418篩選出穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細胞株 將細胞稀釋到1000個細胞/ml，在100μg/ml-1mg/ml

14、的G418濃度范圍內(nèi)進行篩選，選擇出在10-14天內(nèi)使細胞全部死亡的最低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細胞的代謝G418的濃度和活性都會下降，所以每3-5天都要更換一次含有G418的篩選液。熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，14天后，即可篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株。 3．測定基因沉默效果 分別采用FQ-PCR的方法檢測目的基因的mRNA表達情況和用Western-blot方法檢

15、測Survivin蛋白表達，測定基因沉默效果。 4．MTT檢測細胞增殖水平 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染垂體瘤細胞（GH3細胞）。按實驗設計的分組（空白對照組，陰性對照組以及陽性組）情況，將細胞分入96-孔培養(yǎng)板培養(yǎng)。第2天后進行MTT分析，檢測對RNAi靶點有效干擾后的垂體瘤細胞增殖水平變化。 5．PI染色流式細胞技術(shù)檢測GH3細胞的細胞凋亡 培養(yǎng)生長狀態(tài)良好且已穩(wěn)定轉(zhuǎn)染垂體瘤細胞（GH3細胞）。按實驗

16、設計的分組（空白對照組，陰性對照組以及陽性組）情況，進行PI染色流式細胞儀分析，檢測對RNAi靶點有效干擾后的垂體瘤細胞周期及凋亡的變化。 結(jié)果: 1．FQ-PCR結(jié)果顯示，siRNA載體1＃、2＃對GH3細胞中Survivin基因的表達有顯著敲減作用。它們的敲減效率分別為54．4％和54．0％。Western-blot結(jié)果顯示了類似的結(jié)果。 2．MTT檢測細胞增殖水平實驗結(jié)果表明，實驗組1＃，2＃的增殖抑制率（

17、IR）分別為42．5％和38．7％，與陰性對照組和空白對照組相比差異有顯著性（P<0．05），這一結(jié)果提示在Survivin被沉默后，垂體瘤細胞的增殖能力明顯減弱，腫瘤細胞的生長能力明顯被抑制。 3．通過PI染色流式細胞方法檢測細胞群體中各時期細胞的比例，我們發(fā)現(xiàn)，兩個siRNA載體組與對照組比較，在Survivin被沉默以后，垂體瘤細胞群體中，凋亡細胞增加（P<0．05）。 結(jié)論: 1．Survivin基因?qū)τ?/p>