靶向Survivin的siRNA基因治療骨肉瘤的實驗研究.pdf

1、華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文靶向Survivin的siRNA基因治療骨肉瘤的實驗研究姓名：李鯤申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)（骨外）指導(dǎo)教師：楊述華20060401華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文靶向survivin的siRNA基因治療骨肉瘤的實驗研究博士研究生：李鯤導(dǎo)師：楊述華中文摘要第一部分survivin短發(fā)夾狀RNA表達載體的構(gòu)建及鑒定目的設(shè)計并構(gòu)建人suwivin短發(fā)夾狀RNA表達載體，測定其序列，并初步觀察其抑制人骨肉瘤細胞s

2、urvivinmRNA、蛋白表達及細胞增殖的情況，為應(yīng)用sun，ivin短發(fā)夾狀RNA表達載體抑制人骨肉瘤細胞系MG63增殖的實驗研究提供基礎(chǔ)。方法參照二l二涉RNA的設(shè)計原則，選擇合適的靶序列，設(shè)計并合成出特異性的發(fā)夾狀序列，將其接入pSilence21neo表達載體，篩選陽性克隆，擴增后進行基因序列測定。脂質(zhì)體介導(dǎo)pSilence21neo—survivin載體轉(zhuǎn)染人骨肉瘤細胞系MG一63，RTPCR法檢測轉(zhuǎn)染前后人骨肉瘤細胞sur

3、vivinmRNA的表達情況，免疫組化檢測轉(zhuǎn)染前后人骨肉瘤細胞sunrivin蛋白的表達情況，MTT法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞增值情況的變化。結(jié)果經(jīng)基因序列測定證實短發(fā)夾狀RNA構(gòu)建成功，RTPCR結(jié)果顯示，pSilence21一neo—survivin載體轉(zhuǎn)染能顯著抑制survivinmRNA及蛋白的表達，轉(zhuǎn)染后24h、48h、72hmRNA表達抑制率分別為6852％、7487％和7193％，其抑制作用在24h一48h逐步增加，48h一72h

4、有所減低，余各組之間無明顯差別。免疫組化結(jié)果顯示PI值分別為空白組的3776％、282l％、3334％。MTT法顯示轉(zhuǎn)染組24h、48h、72h、96h的細胞增殖抑制率分別為5015％、6l83％、5846％、4235％。結(jié)論成功構(gòu)建了survivin短發(fā)夾狀RNA表達載體pSilence21neo—survivin，并初步證實了其抑制survivin蛋白表達的效果，為進一步研究survivin干涉RNA抑制人骨肉瘤細胞增殖的實驗研究提