垂體生長(zhǎng)激素腺瘤靶向性基因治療的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、我們對(duì)受體介導(dǎo)的GE7基因?qū)胂到y(tǒng)的靶向性轉(zhuǎn)染及垂體生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子的靶向性轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了評(píng)價(jià),并將二者結(jié)合應(yīng)用于垂體腺瘤的基因治療,進(jìn)行了以下幾方面的探索:1.大鼠垂體生長(zhǎng)激素腺瘤(GH<,3>)細(xì)胞、人骨髓瘤(U-2OS)細(xì)胞和人卵巢癌(HO8910PM)細(xì)胞表面表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFP)的表達(dá);目的:判明實(shí)驗(yàn)細(xì)胞GH<,3>細(xì)胞、U-2OS細(xì)胞和HO8910PM細(xì)胞的EGFR表達(dá)情況.方法:實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用免疫組織化學(xué)的方法,取細(xì)胞附壁良好

2、的蓋玻片,經(jīng)內(nèi)酮固定,1％H<,2>O<,2>作用,非免疫羊血清覆蓋,依次加一抗、二抗孵化,0.05％DAB+0.03％H<,2>O<,2>顯色,蘇木素襯染、分化,封片,鏡檢,棕黃色為陽(yáng)性結(jié)果.結(jié)論:實(shí)驗(yàn)證明GH<,3>細(xì)胞、HO8910PM細(xì)胞表面EGFR強(qiáng)表達(dá),U-2OS細(xì)胞表面無(wú)EGFR表達(dá).該研究擬應(yīng)用EGFP介導(dǎo)的GE7基因?qū)胂到y(tǒng)達(dá)到靶向性基因轉(zhuǎn)染的目的.這一結(jié)果表明:(1)GH<,3>細(xì)胞可以作為GE7基因?qū)胂到y(tǒng)基因治療

3、研究的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞;(2)U-2OS細(xì)胞可以作為陰性對(duì)照細(xì)胞;(3)HO8910MP細(xì)胞可以作為陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞.2.細(xì)胞特異性表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建;目的:構(gòu)建人生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子(human growth hormone promoter,hGHp)調(diào)控的報(bào)告基在及殺傷基因表達(dá)質(zhì)粒.方法:根據(jù)GenBank中hGHp的核苷酸序列和基因克隆的要求,用PCGENE軟件進(jìn)行分析,選擇最佳擴(kuò)增引物,通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),得到hGHp的克隆,經(jīng)測(cè)序證實(shí).

4、將作為載體的質(zhì)粒pGL3-Basic雙酶切,并與hGHp粘端連接,構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pGL3-Basic-hGHp.通過(guò)相似的步驟完成殺傷基因質(zhì)粒pcDNA3.1/His A-hGHp-TK的構(gòu)建.結(jié)論:應(yīng)用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),可以得到正確的hGHp片段,并通過(guò)重組質(zhì)粒的方法,成功構(gòu)建hGHp調(diào)控的報(bào)告基因及殺傷基因質(zhì)粒.3.基因治療系統(tǒng)轉(zhuǎn)染及表達(dá)的研究;目的:評(píng)價(jià)基因治療系統(tǒng)的有效性及靶向性.方法:應(yīng)用GE7基因?qū)胂到y(tǒng),將報(bào)告質(zhì)粒pGL3

5、-Basic-hGHp分別轉(zhuǎn)染GH<,3>、U-2OS及HO8910PM細(xì)胞,通過(guò)測(cè)定報(bào)告基因——熒光素酶(luciferase,Luc)基因表達(dá)活性,證明基因治療系統(tǒng)的有效性和靶向性.同樣應(yīng)用GE7基因?qū)胂到y(tǒng),將殺傷基因質(zhì)粒pcDNA3.1/His A-hGHp-TK轉(zhuǎn)染GH<,3>、U-2OS及HO8901PM細(xì)胞,經(jīng)Western blot檢測(cè),證明基因治療系統(tǒng)的有效性和靶向性.同時(shí),研究轉(zhuǎn)染GH<,3>細(xì)胞的最佳劑量、最佳轉(zhuǎn)染

6、時(shí)間及表達(dá)時(shí)間.結(jié)論:(1)研究所采用的基因治療系統(tǒng)是高效的,能夠?qū)⒆懔康哪康幕驅(qū)爰?xì)胞,并保證目的基因有較高的表達(dá).(2)該基因治療系統(tǒng)具有較強(qiáng)的靶向性,其中GE7基因?qū)胂到y(tǒng)的靶向性轉(zhuǎn)染,將目的基因?qū)隕GFR高表達(dá)的細(xì)胞;生長(zhǎng)激素啟動(dòng)子的靶向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控目的基因只在分泌生長(zhǎng)激素的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄并表達(dá);二者結(jié)合的雙重靶向性保證目的基因只在GH<,3>細(xì)胞中發(fā)揮作用.4.基因治療的體外實(shí)驗(yàn);目的:評(píng)價(jià)基因治療系統(tǒng)進(jìn)行體外細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的效果

7、和靶向性.方法:應(yīng)用GE7系統(tǒng)將pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK分別轉(zhuǎn)染GH<,3>、U-2OS和HO8910PM三種細(xì)胞24小時(shí),換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),加入GCV0.1μg/孔,培養(yǎng)48小時(shí),MTT法觀察細(xì)胞殺傷靶向性.GH<,3>細(xì)胞GE7轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK后,按0.1.2.4.8.16μg/ml16個(gè)梯度加入GCV 0.1ml/孔,培養(yǎng)48小時(shí),MTT法觀察GCV的殺傷效果,選擇最佳G

8、CV濃度(最低的有效濃度).GH<,3>細(xì)胞GE7轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK,24小時(shí)后加入GCV,培養(yǎng)24小時(shí),每隔24小時(shí)更換1次GCV,MTT法在第1~7天每天觀察殺傷效果.結(jié)論:(1)應(yīng)用GE7轉(zhuǎn)染的hGHp調(diào)控的HSV-TK基因能將無(wú)毒藥物前體GCV代謝成毒性產(chǎn)物,有效殺傷腫瘤細(xì)胞.(2)該基因治療系統(tǒng)能特異性殺傷靶細(xì)胞——GH<,3>細(xì)胞,而對(duì)作為對(duì)照的U-2OS和HO8910PM細(xì)胞沒(méi)有影響.(3)對(duì)于

9、GH<,3>細(xì)胞,GCV最佳殺傷濃度為4μg/ml;轉(zhuǎn)染并用GCV殺傷3天后GH<,3>細(xì)胞增殖速度明顯減慢.5.基因治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究;目的:建立垂體腺瘤動(dòng)物模型,觀察體內(nèi)基因治療的效果.方法:將GH<,3>細(xì)胞懸液(1.0×10<'7>)注射于裸鼠右腋皮下,制成垂體腺瘤裸鼠模型.瘤體內(nèi)直接注射GE7介導(dǎo)的pcDNA3.1/HisA-hGHp-TK(2.0μg),24小時(shí)后腹腔注射GCV(100mg·kg<'-1>.d<'-1>),第