EphA2與胃癌奧沙利鉑耐藥細胞EMT關系的初步研究.pdf

1、背景:
　　胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，化療作為胃癌術后最有效的輔助治療手段之一，在防治胃癌的復發(fā)與轉移方面的作用舉足輕重。奧沙利鉑(Oxaliplatin，L-OHP)是繼順鉑和卡鉑之后的第三代鉑類抗癌藥，已逐漸成為治療進展期胃癌的主要藥物，并顯示出良好的應用前景，但部分胃癌患者仍表現(xiàn)出對鉑類化療藥物耐藥。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)被認為是誘發(fā)腫瘤浸潤和轉

2、移的早期關鍵事件，而近幾年的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中EMT的發(fā)生與腫瘤細胞的耐藥性有密切關系。一種觀點認為已發(fā)生EMT的腫瘤細胞對化療藥物敏感性降低。另一種觀點認為當腫瘤細胞通過逐漸誘導的方法建立耐藥細胞株往往會發(fā)生EMT;而逆轉EMT，能夠增加耐藥細胞株對藥物的敏感性。這種由于腫瘤細胞發(fā)生EMT而獲得的耐藥性，成為后期治療的難題，因此研究腫瘤細胞EMT發(fā)生與耐藥的關系對于腫瘤治療具有重要的現(xiàn)實意義。我們前期關于EphA2在胃癌侵襲轉移和耐藥

3、機制方面的研究發(fā)現(xiàn)，將pEGFP-N1-CMV-EphA2慢病毒過表達載體轉染入胃癌SGC-7901細胞后，EphA2過表達的胃癌細胞獲得間質樣表型，侵襲能力更強，EMT核轉錄因子Snail、間質細胞標記物N-cadherin和Wnt/β-catenin通路相關因子β-catenin、TCF-4、cyclinD1蛋白水平上調，而上皮細胞標記物E-cadherin蛋白水平下降，提示EphA2可能通過Wnt/β-catenin通路調控胃癌細

4、胞EMT的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)EphA2過表達組胃癌細胞對不同濃度的奧沙利鉑敏感性均降低，說明EphA2在胃癌細胞奧沙利鉑耐藥過程中可能發(fā)揮重要作用。為進一步揭示EphA2在胃癌細胞EMT發(fā)生和耐藥中的作用，本研究建立人胃癌奧沙利鉑耐藥細胞株SGC-7901/L-OHP，研究其細胞生物學特點以及靶向沉默EphA2在SGC-7901/L-OHP細胞中的表達能否逆轉其EMT發(fā)生從而影響其對奧沙利鉑的敏感性。
　　目的:初步探討EphA2與胃

5、癌奧沙利鉑耐藥細胞EMT關系。
　　方法:
　　人胃癌SGC-7901細胞在1640培養(yǎng)液中，37℃、5％的CO2飽和濕度下培養(yǎng)，用0.25％的胰蛋白酶消化傳代;采用逐步遞增濃度間歇誘導法建立人胃癌奧沙利鉑耐藥細胞株SGC-7901/L-OHP;應用倒置相差顯微鏡觀察耐藥細胞株的形態(tài)學改變;通過細胞計數(shù)法繪制細胞生長曲線，根據(jù)公式:Td(h)=T×[log2/(logN-logN0)]，計算耐藥細胞系的倍增時間;應用噻唑藍(

6、MTT)比色法測定耐藥細胞株對奧沙利鉑的敏感性及耐藥指數(shù);采用實時熒光定量RT-PCR和Western-blot方法測定耐藥細胞株與親代細胞株中的EphA2表達;并采用RNA干擾技術靶向沉默EphA2在胃癌奧沙利鉑耐藥細胞中的表達，qRT-PCR和Western blot檢測EMT相關因子上皮細胞標記物E-cadherin，間質細胞標記物N-cadherin和核轉錄因子Snail的表達水平，MTT法檢測沉默EphA2對胃癌奧沙利鉑耐藥細

7、胞L-OHP敏感性變化。
　　結果：
　　1.歷時6個月建成人胃癌奧沙利鉑耐藥細胞株SGC-7901/L-OHP。SGC-7901/L-OHP細胞呈梭形貼壁生長，細胞變?yōu)殚L條形與梭形，邊緣伸出長角，細胞間連接較松散，獲得了間質樣表型;繪制細胞生長曲線發(fā)現(xiàn)SGC-7901/L-OHP細胞的群體倍增時間為27.44±2.01h，與胃癌SGC-7901細胞相比，增殖速度減慢，群體倍增時間延長約3h(P＜0.05)。隨濃度增高，L-

8、OHP對胃癌SGC-7901細胞以及SGC-7901/L-OHP細胞的抑制作用逐漸增強，同一濃度L-OHP對SGC-7901/L-OHP細胞的抑制率明顯低于胃癌SGC-7901細胞(P＜0.05)，胃癌奧沙利鉑耐藥SGC-7901/L-OHP細胞對L-OHP的耐藥指數(shù)為9.7，并且經反復傳代、凍存、復蘇后，復測其耐藥指數(shù)仍保持不變。
　　2.與胃癌SGC-7901細胞比較，SGC-7901/L-OHP細胞中EphA2mRNA和蛋白

9、的表達明顯上調(P＜0.05）。
　　3.EphA2 siRNA能明顯抑制SGC-7901/L-OHP細胞中EphA2mRNA和蛋白的表達(P＜0.05)。
　　4.沉默SGC-7901/L-OHP細胞中EphA2的表達，能夠顯著上調E-cadherin mRNA和蛋白的表達(P＜0.05），并下調N-cadherin和SnailmRNA和蛋白的表達(P＜0.05)，并且增加SGC-7901/L-OHP細胞對L-OHP的敏感

10、性(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.利用濃度梯度遞增法誘導建立的人胃癌奧沙利鉑耐藥細胞株SGC-7901/L-OHP，具有穩(wěn)定的耐藥性，可為體外腫瘤細胞耐藥研究提供良好的實驗模型。
　　2.人胃癌奧沙利鉑耐藥細胞株SGC-7901/L-OHP中EphA2呈過表達，并且EphA2參與了胃癌細胞在耐藥形成過程中EMT的發(fā)生。
　　3.EphA2 siRNA能夠抑制胃癌奧沙利鉑耐藥SGC-7901/L-OHP細胞