環(huán)巴胺(Cyclopamine)聯(lián)合奧沙利鉑抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的研究.pdf

1、目的:(1)研究Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路在正常胃上皮細(xì)胞和胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況。(2)研究Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路特異性抑制劑環(huán)巴胺(Cyclopamine)與奧沙利鉑單藥和聯(lián)合用藥對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期以及Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路的影響。
　　方法:(1)采用RT-PCR方法檢測(cè)了胃永生化上皮細(xì)胞GES.1和胃癌細(xì)胞BGC-823、SGC-7901和MKN-45中Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路各信號(hào)分子的表達(dá)水平;(

2、2)采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)了MKN45細(xì)胞GLI蛋白的表達(dá);(3)采用CCK-8法檢測(cè)了不同濃度環(huán)巴胺和奧沙利鉑單藥和聯(lián)合用藥對(duì)MKN-45細(xì)胞增殖的影響;觀察聯(lián)合環(huán)巴胺是否可以提高奧沙利鉑抑制細(xì)胞增殖的作用(4)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了環(huán)巴胺和奧沙利鉑對(duì)MKN-45細(xì)胞凋亡和周期分布的影響;(5)采用Western-blotting檢測(cè)了環(huán)巴胺和奧沙利鉑對(duì)Hedgehog信號(hào)通路蛋白SHH、GLI1表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)

3、半定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在胃永生化細(xì)胞GES-1和胃癌細(xì)胞BGC-823、SGC-7901和MKN-45中都存在Hedgehog信號(hào)傳導(dǎo)通路的表達(dá)。PTCH和SHH在所有細(xì)胞中表達(dá)均上調(diào),GLI在GES-1和SGC-7901中未見(jiàn)表達(dá)。(2)GLI在MKN-45細(xì)胞存在表達(dá),定位于胞核和胞漿。(3)不同濃度的環(huán)巴胺和奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)胞株MKN-45作用24小時(shí)、36小時(shí)、48小時(shí)后,均顯示出明顯的細(xì)胞增殖抑制作用,并呈濃度和時(shí)間依賴性;而在

4、GES-1細(xì)胞中未觀察到環(huán)巴胺對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用;環(huán)巴胺和奧沙利鉑聯(lián)合用藥較單藥能更有效抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)。當(dāng)15uM環(huán)巴胺聯(lián)合10ug/ml奧沙利鉑時(shí),細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率超過(guò)15uM環(huán)巴胺和15ug/ml奧沙利鉑單藥的抑制率。(4)環(huán)巴胺和奧沙利鉑單藥均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并呈濃度和時(shí)間依賴性。兩藥聯(lián)用后,MKN-45細(xì)胞凋亡比例較單藥明顯增加(P<0.05)。隨環(huán)巴胺藥物濃度的逐漸遞增,MKN45細(xì)胞G0/G1期比例逐漸增加,S

5、期比例逐漸降低;奧沙利鉑也可增加G0/G1期比例,降低S期比例;兩藥聯(lián)合作用后,MKN-45細(xì)胞G0/G1期和G2/M期比例較單藥增加更高,S期明顯降低(P<0.001)。(5)Western-blotting顯示:環(huán)巴胺可以下調(diào)MKN-45細(xì)胞Hedgehog信號(hào)通路中的SHH和GLI蛋白的表達(dá),奧沙利鉑單藥對(duì)SHH和GLI的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　結(jié)論:(1)正常胃上皮細(xì)胞GES-1中存在Hedgehog信號(hào)通路,但不表達(dá)下游轉(zhuǎn)

6、錄因子GLI,而胃癌細(xì)胞株MKN-45和BGC-823中存在Hedgehog信號(hào)通路的激活,SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)可能不依靠Hedgehog信號(hào)通路的激活。(2)GLI表達(dá)于MKN-45細(xì)胞胞漿和胞核中。(3)環(huán)巴胺和奧沙利鉑單藥和聯(lián)合用藥均可抑制胃癌MKN-45細(xì)胞株的增殖,兩藥聯(lián)用較單藥作用更明顯。(4)環(huán)巴胺和奧沙利鉑均可誘導(dǎo)MKN-45細(xì)胞凋亡,使S期DNA合成降低,兩藥聯(lián)用較單藥作用更明顯。提示環(huán)巴胺可提高奧沙利鉑對(duì)胃癌細(xì)