蛋白酶激活受體-2在實驗性肝纖維化中的表達及其意義.pdf

1、背景：肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的必經(jīng)環(huán)節(jié)，但肝纖維化的發(fā)病機制目前仍不十分清楚。近年來有報道提出肥大細胞(mastcell，MC)直接或間接參與了其他纖維化疾病的病理過程，但其具體機制復雜，至今尚未完全明了。推測肥大細胞分泌類胰蛋白酶等調(diào)節(jié)因子，通過后者激活靶細胞膜上的蛋白酶激活受體-2(proteaseactivatedreceptor-2，PAR-2)來促進其膠原合成。鑒于MC參與肝纖維化過程，推測PAR-2亦在肝纖維化中

2、發(fā)揮重要作用，但未得到進一步證實。 目的：觀察肝纖維化大鼠模型中PAR-2的表達及其與肝纖維化的關系。 方法：1.建立大鼠肝纖維化模型：模型組給予40％CCl4花生油溶液2.5ml/kg皮下注射，每周2次，連續(xù)12周。對照組給予等量的生理鹽水。分別于造模2、4、8、12周處死大鼠。 2.對肝組織進行常規(guī)HE染色及Masson膠原染色評價大鼠肝纖維化程度。 3.甲苯胺藍染色法對肝組織中肥大細胞進行染色與計數(shù)

3、。 4.肝組織中羥脯氨酸含量的測定：采用羥脯氨酸堿水解法測試盒(南京建成生物工程研究所)。 5.采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)方法檢測正常對照組及造模2、4、8、12周大鼠肝組織中PAR-2mRNA的表達。所用試劑、器材為：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國promega公司)，JS-380自動凝膠圖象分析儀(武漢協(xié)和醫(yī)院胃腸病實驗室)。 6.免疫組化方法檢測PAR-2蛋白的表達及定位。所用試劑為：羊抗PAR-2多克隆抗

4、體(美國SantaCruz公司)，SP免疫組化試劑盒(北京中山公司)，DAB顯色試劑盒(華美生物工程公司)。 結(jié)果：1.隨著造模時間的延長，肝臟纖維化程度逐漸加重。正常肝組織中纖維面積不足1％，而模型組2、4、8、12周纖維組織面積分別約5％、11％、16％、25％。 2.正常對照組大鼠肝組織中MC數(shù)量很少(2.533±0.952)，主要沿肝臟匯管區(qū)分布；模型組：2周后，MC數(shù)量增加(造模2周vs.正常對照組，9.080

5、±0.540vs.2.533±0.952，P＜0.05)，4周后顯著增加(造模4周vs.造模2周，15.667±2.906vs.9.080±0.540，P＜0.05)，8周后數(shù)量進一步增加(造模8周vs.造模4周，32.040±3.278vs.15.667±2.906，P＜0.05)；多見匯管區(qū)、中央靜脈周圍MC密集分布。初期MC多分布于匯管區(qū)，在肝纖維化后期還可沿纖維間隔分布。纖維化8周后，可見MC胞體增大，出現(xiàn)較多脫顆?，F(xiàn)象。

6、 3.隨著造模時間的延長，肝臟羥脯氨酸的含量逐漸升高。 4.正常對照組中幾乎檢測不到PAR-2mRNA的表達；造模2周肝組織可有少量PAR-2mRNA表達(PAR-2/β-actin造模2周vs.正常對照組，0.148±0.013vs.0，P＜0.05)，4周表達增加(PAR-2/β-actin造模4周vs.造模2周，0.351±0.021vs.0.148±0.013，P＜0.05)，8周后維持在較高水平(PAR-2/β-ac

7、tin造模8周vs.造模4周，0.803±0.016vs.0.351±0.021，P＜0.05)。 5.正常對照組中PAR-2mRNA蛋白表達少(陽性信號灰度156.035±0.514)；造模2周肝組織可見少量PAR-2蛋白的表達(陽性信號灰度造模2周vs.正常對照組，162.464±1.280vs.156.035±0.514，P＜0.05)，4周表達增加(陽性信號灰度造模4周vs.造模2周，174.751±1.257vs.16

8、2.464±1.280，P＜0.05)，8周后維持在較高水平(陽性信號灰度造模8周vs.造模4周，185.654±2.102vs.174.751±1.257，P＜0.05)。PAR-2主要在肝星狀細胞、血管內(nèi)皮細胞、匯管區(qū)成纖維細胞等部位表達。 結(jié)論：1.肥大細胞參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程。 2.PAR-2mRNA及蛋白的表達水平與肝纖維組織面積、肥大細胞數(shù)量、羥脯氨酸含量的增加相一致，提示PAR-2的激活與肝纖維化有關