孤啡肽受體拮抗劑對對機械性損傷神經元存活率的影響.pdf

1、孤啡肽受體（orphanin receptor.ORL-1）是1994年發(fā)現的一種內源性阿片肽受體，其在中樞和外周組織都有廣泛分布，并且參與機體的各項重要生理活動調節(jié)。其內源性配基孤啡肽（orphanin-FQ，OFQ）在第二年被發(fā)現，是目前發(fā)現的孤啡肽受體唯一的配基，在機體中同樣發(fā)揮著重要的功能。文獻顯示,創(chuàng)傷性腦損傷后孤啡肽（OFQ）的表達明顯升高,有學者推測，OFQ/ORL1系統(tǒng)可能在創(chuàng)傷性腦損傷后發(fā)揮重要的作用。本實驗通過在體外

2、原代神經元細胞培養(yǎng)損傷模型的細胞培養(yǎng)液中給予孤啡肽受體阻斷劑（Nphe）的方法，研究了不同劑量的孤啡肽受體阻斷劑對機械性神經元損傷的影響，并初步探討其可能的機制，為深入認識OFQ/ORL1系統(tǒng)在創(chuàng)傷性腦損傷中的分子學作用奠定基礎。
　　實驗一體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經元機械性損傷模型的建立
　　目的：驗證細胞水平建立體外培養(yǎng)皮層神經元機械性損傷模型，為下一步進行神經系統(tǒng)損傷的分子病理學實驗奠定基礎。
　　方法：進行胎鼠大腦

3、皮層組織神經元體外原代培養(yǎng)，并進行觀察，神經元成活1周，鑒定神經元純化率后，用槍頭劃傷神經元細胞造成損傷。觀測細胞的形態(tài)學與存活率變化，并利用培養(yǎng)液乳酸脫氫酶活性變化反映細胞病理狀態(tài)，從而證實模型的效果。
　　結果：神經元體外培養(yǎng)1周，光鏡下見細胞核大而清晰、透亮，圓形，核仁明顯。胞體呈多形性，胞質透亮，細胞具有折光性，自胞體伸出較多突起，神經元突起間相互聯系成網。NF200免疫組織化學染色細胞陽性率達90％。機械性劃割后可見損傷

4、區(qū)神經元立即壞死，細胞存活率下降，培養(yǎng)液乳酸脫氫酶活性升高。
　　結論：胎鼠大腦皮層組織體外原代培養(yǎng)生成的神經元純化率較高，該模型是一種簡單而有效的體外培養(yǎng)神經元機械性損傷模型。
　　實驗二神經元機械損傷后孤啡肽受體的表達及其拮抗劑Nphe對神經元的保護作用
　　目的：觀察體外實驗中神經元機械性損傷后ORL-1受體的表達和特異性阻斷其受體ORL-1能否對損傷的神經元具有保護作用。
　　方法：神經元機械性損傷后，通

5、過WesternBlot方法檢測ORL-1的表達，用其特異性阻斷劑（[Nphe1]-NC(1-13)-NH2,Nphe）阻斷OFQ受體ORL-1，通過乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，MTT測定，研究損傷后對神經元損傷的保護作用。
　　結果：體外培養(yǎng)神經元機械性損傷后，神經元機械性損傷后，觀測不同劑量Nphe處理LDH值的變化，測定了各處理組在不同時間點（30min,1h,3h,6h,12h,2

6、4h,48h）的LDH活性，提示Nphe能夠減少LDH數值，并存在劑量依賴性。損傷后12h，損傷后通過MTT測定細胞存活率，對照組和不同劑量Nphe處理組的細胞存活率分別為36％和49％、58％、65％、72％、80％、84％、85％，有明顯統(tǒng)計學差別（P<0.05）,且存在劑量依賴性。Western Blot方法檢測ORL-1表達水平無明顯變化。
　　結論：ORL-1在神經元機械性損傷后持續(xù)穩(wěn)定表達，其特異性阻斷劑Nphe能夠減

7、少機械性損傷后繼發(fā)性神經元損害，對神經元具有一定的保護作用，OFQ/ORL-1系統(tǒng)可能在創(chuàng)傷性腦損傷中發(fā)揮著一定作用。
　　實驗三Nphe對神經元機械損傷后的保護作用機理初步研究
　　目的：Nphe對神經元的保護作用已經被證明，但其具體的作用機理尚不清楚，本實驗檢測了神經元機械損傷后細胞內Ca2+，Caspase-3含量變化。
　　方法：神經元機械性損傷后，用ORL-1的特異性阻斷劑（[Nphe1]-NC(1-13)-