DZX調控lncRNA S66184對損傷神經元的保護作用.pdf

1、缺血性腦血管病以其發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點嚴重影響了人民的生命健康和生活質量，給社會和家庭造成沉重的負擔。缺血再灌注（I/R）引起神經元凋亡是導致腦組織損傷的主要原因。而線粒體ATP敏感性鉀通道（KATP）開放劑二氮嗪（DZX），能夠降低神經細胞凋亡率，對神經元的損傷有保護作用。目前二氮嗪（DZX）在保護神經元上的分子機制尚不明確。因此，本課題通過細胞分子生物學技術試圖探究二氮嗪（DZX）對神經保護的分子機制。
　　目的

2、：
　　第一部分探索ATP敏感K通道基因表達與腦神經元損傷之間的關系，試圖對KATP通道開放劑DZX治療腦神經元損傷的相關基因及其可能的下游靶標進行觀察。
　　第二部分探索ATP敏感鉀通道開放劑DZX作用對氧糖剝奪引起的海馬神經元損傷的保護作用，試圖說明DZX減少神經凋亡的作用和機制。
　　第三部分探索ATP敏感鉀通道開放劑DZX對缺血再灌注中大鼠神經損傷的保護作用。
　　第四部分尋找 DZX與下游靶分子之間存在

3、 lncRNAs“橋梁”分子，并研究它們之間調控關系，進一步說明DZX對損傷神經元有保護作用。
　　方法：
　　第一部分通過生物信息學分析在腦缺血再灌注中 ATP敏感性鉀通道差異表達的基因；對海馬腦片進行氧糖剝奪處理：進一步應用膜片鉗檢測不同藥物預處理海馬腦片氧糖剝奪模型后，海馬神經元KATP通道電流的變化。
　　第二部分通過分離培養(yǎng)海馬神經元，構建氧糖剝奪的海馬神經元細胞和腦片模型；應用細胞免疫熒光法、MTT法、LD

4、H測定法、TUNEL染色法來鑒定模型構建情況；對原代海馬神經元細胞進行不同處理，分為：NC組，OGD組，DZX+OGD組， DZX+5-HD+OGD組， TG+DZX+OGD組，用流式細胞技術分別檢測各組的海馬神經元細胞的凋亡率。和應用RT-PCR檢測法檢測在不同藥物作用下氧糖剝奪的海馬神經元細胞和腦片中凋亡相關基因 caspase3,caspase12,Bax表達的改變情況。
　　第三部分采用線栓塞法構建缺血再灌注大鼠模型，采用

5、腦立體定位側腦室注射法給藥，TTC染色法鑒定模型構建情況；應用神經功能缺損評分了解神經損傷嚴重程度；對動物模型進行不同處理分為以下四組：假手術組，DZX+I/R組，DZX+5-HD+ I/R組，DZX+ TG+I/R組，對經過不同處理大鼠應用水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力；應用TTC染色法檢測大鼠腦梗死面積變化情況；應用HE染色法檢測大鼠腦梗死面積的組織學變化情況和應用TUNEL檢測法檢測大鼠腦組織細胞凋亡變化情況。
　　第四

6、部分通過lncRNA芯片分析尋找DZX與下游靶分子之間存在lncRNAs“橋梁”分子；缺血再灌注模型大鼠分為假手術組、I/R組、 DZX+I/R組、DZX+5-HD+ I/R組，DZX+ TG+I/R和 DZX+5-HD+ TG+ I/R組，各組應用RT-PCR驗證差異基因，發(fā)現lncRNA S66184的表達與DZX密切相關；構建氧糖剝奪的海馬神經元細胞模型，應用lncRNA過表達轉染實驗及RT-PCR技術，驗證DZX對lncRNA

7、S66184的調控關系。
　　結果:
　　第一部分：
　　1.通過GSE23160芯片分析挖掘出與腦缺血再灌注大腦皮層（Cortex）和腦紋狀體（Striatum）中KATP敏感表達異常的基因，其中有7個差異基因同時存在皮質和紋狀體中，這7個基因是 GPR84、GJB2、DSCR1、TLR2、GPR84、GJB2、CDKN1A。在腦缺血再灌注24小時內表達量顯示：皮質中KATP敏感基因GPR84、GJB2、DSCR1、

8、TLR2、GPR84、GJB2隨著腦損傷程度的增加（及缺血時間的增加）而增加；CDKN1A在缺血再灌注8小時的時候表達量達到最大，隨后隨缺血再灌注時間的增加下降；在腦缺血再灌注24小時內紋狀體中KATP敏感基因 GPR84、GJB2、TLR2、GPR84、GJB2隨著腦損傷程度的增加（及缺血時間的增加）而增加；DSCR1、CDKN1A在8小時的時候達到最高狀態(tài)，隨后隨缺血再灌注時間的增加下降。
　　2.觀察神經元KATP通道電流變

9、化的膜片鉗實驗結果顯示，OGD組電流顯著升高表明造模成功。相對正常組KATP電流密度（53.3±5.3），OGD組的電流密度（93.2±5.4）顯著增高，DZX+OGD組的電流密度恢復到正常組大小（53.2±3.0），DZX+5-HD+OGD組（83.4±4.8）升高表明5-HD部分抑制DZX的神經保護作用。TG+DZX+OGD組的KATP通道電流密度為（66.9±11.1），明顯低于OGD組，但與DZX+OGD組相比稍高，這表明DZX

10、可部分抑制ERS通路從而對OGD引起的神經元損傷有保護作用。
　　第二部分：
　　1.原代海馬神經元的培養(yǎng)及鑒定：培養(yǎng)72h可見神經元伸出的多個突起進一步伸長，可觀察到突起末端的生長錐，還常見到多個神經元聚集在一起，向四周發(fā)出樹枝狀神經突起，形成稀疏的神經網絡，隨著時間延長，突起延長增粗，網絡變得稠密，神經元胞體逐漸增大。用FITC標記的MAP2和PE標記的Tau-1抗體染色鑒定神經元，Hoechst33258染細胞核，熒光

11、顯微鏡下觀察神經元樹突被染上了綠色，軸突染上紅色，細胞核染上藍色。以上結果證明通過原代培養(yǎng)所得到的細胞確實是海馬神經元細胞。
　　2. MTT檢測氧糖剝奪后海馬神經元細胞的活性：經氧糖剝奪處理后，與正常組相比，氧糖剝奪處理組中海馬神經元細胞的吸光值明顯下降，說明活細胞的數量再減少。而且隨著氧糖剝奪后時間的延長，死亡的海馬神經元細胞越多。
　　3. LDH釋放量的測定：經氧糖剝奪后，與正常組相比，氧糖剝奪組中海馬神經元細胞LD

12、H的釋放量比正常細胞顯著增大，而且隨著氧糖剝奪后時間的延長，釋放的LDH越來越多，說明死亡的海馬神經元細胞也越來越多。
　　4.大鼠海馬腦片氧糖剝奪模型用 TUNEL染色方法鑒定：與正常組相比，氧糖剝奪組中有大量的染色成棕色的陽性細胞，說明在氧糖剝奪模型組中有大量凋亡的細胞出現。成功構建了大鼠腦片的氧糖剝奪模型。
　　5.流式檢測海馬神經元細胞的凋亡情況：與NC相比，OGD組海馬神經元細胞的凋亡顯著增多。DZX+OGD組海馬

13、神經元細胞凋亡率比 OGD組凋亡率明顯減少。DZX+5-HD+OGD組中海馬神經元細胞的凋亡率比DZX+OGD組顯著增加，但是還是比OGD組中海馬神經元的凋亡率要低。TG+DZX+OGD組中海馬神經元細胞的凋亡率比DZX+OGD組顯著增加，但是還是比 OGD組中海馬神經元的凋亡率要低。該結果表明鉀離子通道開放劑能抵抗由ERS引起的海馬神經元細胞的凋亡。
　　6. RT-PCR檢測凋亡密切相關基因：與正常對照組相比，模型組中Bax，

14、 Caspase-3，Caspase-12的表達量顯著高于正常對照組中，用DZX處理后，Bax， Caspase-3，Caspase-12的表達量顯著減少。當用鉀離子通道阻斷劑5-HD和ERS誘導劑毒胡蘿卜素TG和DZX一起處理大鼠海馬神經元OGD和大鼠海馬腦片OGD模型后，Bax，Caspase-3，Caspase-12的表達量與DZX+OGD組相比又顯著增加，但又低于模型組。這些結果顯示DZX能保護腦組織，緩解細胞凋亡。
　　

15、第三部分：
　　1.線栓塞法腦缺血模型后24小時后，與正常組相比，取材后發(fā)現在腦缺血模型組中可見明顯的腦梗死部分。因此認為用線栓塞法已經成功構建了腦缺血模型。
　　2.各組大鼠平臺逃避潛伏期的比較：在大鼠建模完成后，開始進行水迷宮實驗，第1天假手術組潛伏期為24.8±4.12s，而I/R模型組大鼠的潛伏期明顯延長為79.5±6.33s， DZX+I/R組潛伏期明顯縮短為48.6±5.71s，DZX+5-HD+ I/R組顯著延

16、長了潛伏期時間為89.3±9.83s。第2和第3天各組的潛伏期均呈現下降趨勢，而I/R模型組的潛伏期時間顯著高于假手術組和DZX+I/R組。
　　3.各組大鼠空間探索實驗結果比較：水迷宮實驗開始后的第4天平臺撤除后，觀察各組大鼠的記憶能力。結果顯示，假手術組大鼠停留平臺象限時間達到33.12±3.34s，I/R模型組的時間為18.56±3.56s，DZX+I/R組為24.23±4.45s，DZX+5-HD+ I/R組為16.45±

17、5.67s，各組穿越原平臺次數分別為4.1±1.2次，1.2±0.2次，2.8±0.3次和1.8±0.5次。模型組大鼠在原平臺象限的停留時間與假手術組相比明顯減少，穿越原平臺象限的次數也明顯減少，二治療組大鼠在原平臺象限的停留時間時間較模型組大鼠可見顯著延長，同時其穿越原平臺的次數也有顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；各組大鼠的游泳速度相比較之間無顯著差異。
　　4.神經功能缺損評分統(tǒng)計分析：與假手術組比，模型組大鼠神經

18、功能缺損得分明顯升高（5.86±0.63），說明已經成功造模，造模后神經損傷嚴重。與模型組比，DZX+I/R組神經功能缺損得分顯著降低(2.63±0.31)，DZX+5-HD+ I/R組神經功能缺損得分再次顯著升高(5.12±0.51)。
　　5.大鼠腦梗死面積：相對于模型組， DZX+I/R組腦梗死面積顯著減少，DZX+5-HD+ I/R組的腦梗死面積也減少。
　　6.大鼠腦梗死面積的組織學分析：假手術組中腦組織比較完整，

19、無明顯異常。但與假手術組相比，在I/R組中可見明顯的壞死腦組織。DZX+I/R組腦部未見明顯的壞死組織。DZX+5-HD+ I/R組腦部有明顯的壞死組織，但是壞死組織比單純的模型組少。
　　7. TUNEL法檢測大鼠腦組織細胞凋亡：TUNEL法染色后20倍物鏡下觀察，凋亡細胞胞核深染，呈棕黃色至褐色。假手術組只有較少的細胞凋亡，假手術組的凋亡指數為（0.33±0.05）。與假手術組相比，模型組中有較多的凋亡細胞，模型組中的凋亡指數

20、為（2.33±0.82）。DZX+I/R組中凋亡的細胞顯著減少，其凋亡指數為（1.33±0.72）。DZX+5-HD+ I/R組凋亡數目明顯增加，其凋亡指數為（1.53±0.52）。
　　第四部分：
　　1.腦缺血再灌注大鼠海馬神經元進行大鼠lncRNAs基因芯片檢測：在假手術組和I/R組的腦組織進行l(wèi)ncRNA基因芯片分析，通過p值和FDR值的閾值確定，有12條lncRNAs在I/R組明顯上調。各組應用RT-PCR驗證差異

21、基因，在腦組織中檢測這12條lncRNAs的表達情況，發(fā)現lncRNA S66184的表達與DZX密切相關。
　　2.大鼠海馬神經元中驗證lncRNA S66184的表達：DZX+I/R組與I/R組對比發(fā)現lncRNA S66184明顯下調。
　　3.大鼠海馬神經元細胞的糖氧剝奪細胞模型中驗證lncRNA S66184的表達：與正常對照組相比，在大鼠海馬神經元細胞糖氧剝奪模型里， lncRNA S66184明顯上調。

22、　　4.大鼠海馬神經元細胞的糖氧剝奪細胞模型與凋亡相關基因之間的關系： RT-PCR的方法來檢測糖氧剝奪與凋亡相關基因的關系。與正常組相比，氧糖剝奪組凋亡相關基因caspase3、caspase7、caspase8、caspase9、caspase12、Bax明顯上調。
　　5.大鼠海馬神經元細胞的糖氧剝奪細胞模型中 DZX與凋亡基因之間的關系：對原代海馬神經元細胞進行不同處理分為：NC組，OGD組，DZX+OGD組，DZX+5-

23、HD+OGD組，RT-PCR檢測相關凋亡基因。與OGD組相比DZX+OGD組的凋亡相關基因被下調，與DZX+OGD組相比DZX+5-HD+OGD組凋亡相關基因被上調，但未超過OGD組凋亡相關基因表達。
　　6.在大鼠海馬神經元細胞的糖氧剝奪細胞模型中DZX與lncRNA S66184對凋亡基因之間的關系：前面得到的lncRNA S66184，在大鼠海馬神經元細胞的糖氧剝奪細胞模型里加入DZX后過表達其表達，DZX對caspase3

24、,caspae12,Bax下調作用被逆轉。
　　結論:
　　第一部分：
　　1.通過生物信息學GSE生物芯片分析證實ATP敏感性鉀離子通道參與了氧糖剝奪神經元損傷病理過程。其中有7個差異基因同時存在皮質和紋狀體中。
　　2.通過電生理膜片鉗檢測發(fā)現KATP開放劑二氮嗪（DZX）可部分抑制ERS通路從而對OGD引起的神經元損傷仍有保護作用。
　　第二部分：
　　1.通過采用原代細胞分離技術成功構建大鼠海

25、馬神經元OGD。
　　2.通過流式細胞凋亡檢測說明ATP敏感鉀通道開放劑DZX對氧糖剝奪引起的海馬神經元損傷有到保護作用。
　　3.通過分別對氧糖剝奪引起的海馬神經元細胞和海馬腦膜片進行研究，觀察到ATP敏感鉀通道開放劑DZX能抵抗由ERS引起的海馬神經元細胞的凋亡。
　　4.ATP敏感鉀通道開放劑DZX通過對凋亡相關基因的調控實現對海馬神經元細胞凋亡的抑制。
　　第三部分：
　　1.通過采用線栓塞法構建腦

26、缺血再灌注的大鼠模型。
　　2. ATP敏感鉀通道開放劑DZX對大鼠I/R損傷有明顯的保護作用。
　　3.ATP敏感鉀通道開放劑DZX對 MCAO大鼠的不同時間學習記憶能力有改善作用。
　　第四部分：
　　1.通過對動物假手術組和I/R組的腦組織進行l(wèi)ncRNA基因芯片實驗分析發(fā)現I/R組上調了12條lncRNAs。
　　2.通過對lncRNA芯片數據驗證發(fā)現lncRNA S66184的表達與DZX密切相關

27、。
　　3.在動物體內實驗和體外細胞實驗驗證發(fā)現ATP敏感鉀通道開放劑DZX與lncRNA S66184存在調控關系。
　　4. ATP敏感鉀通道開放劑DZX對某些凋亡基因的調控作用與動物模型里的實驗結果一致。
　　5.ATP敏感鉀通道開放劑DZX通過調控lncRNA S66184進而調控caspase3,caspase12,Bax的表達，以達到對損傷神經元的保護作用。
　　全文結論:綜上所述，根據實驗數據,我們