活血化瘀中藥活性成分對內(nèi)皮祖細(xì)胞的作用與機(jī)理研究.pdf

1、目的:
　　 內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells，ECs)的前體細(xì)胞，是一群介于血液-血管細(xì)胞與成熟內(nèi)皮細(xì)胞之間的具有較強(qiáng)增殖分化能力、可向血管新生部位趨化并促進(jìn)血管新生的幼稚細(xì)胞。在成人，EPCs存在于骨髓，在機(jī)體缺血、組織損傷、細(xì)胞因子或藥物刺激下，可從骨髓向靶部位動員、歸巢、分化，形成新生血管，在臨床各種缺血性疾病和血管損傷方面有

2、著廣泛的應(yīng)用前景。
　　 腰椎間盤退變性疾病因其高發(fā)病率和高致殘率，嚴(yán)重危害人體健康，造成了沉重的社會負(fù)擔(dān)。椎間盤內(nèi)無血管組織，其營養(yǎng)來源于經(jīng)軟骨終板和纖維環(huán)的滲透作用。終板血供異?？捎绊懽甸g盤基質(zhì)代謝，促使椎間盤退變。將骨髓來源的EPCs移植至腰椎間盤終板周圍可能對腰椎間盤退變病人終板下微循環(huán)的重建具有重要作用。據(jù)文獻(xiàn)報道，益氣活血化瘀中藥可通過改善終板血液循環(huán)以增加椎間盤營養(yǎng)供應(yīng)，調(diào)節(jié)椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，抑制椎間盤

3、炎癥介質(zhì)，但該類中藥如何改善終板血液循環(huán)尚未見明確報道。
　　 本研究通過建立人骨髓來源EPCs分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化與鑒定的方法，篩選出對EPCs數(shù)量和功能有促進(jìn)作用的中藥活性成分，并探討其作用機(jī)制，為腰椎間盤退變性疾病的發(fā)病機(jī)理及其預(yù)防治療的研究提供實驗基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.人骨髓來源EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 采用Ficoll密度梯度離心法，分離腰椎間盤退變性疾病患者骨髓中的單個核細(xì)胞

4、，以3 x106/cm2/密度接種于預(yù)先包被人纖維連接蛋白的25cm2培養(yǎng)瓶中，72h后換液，洗去非貼壁細(xì)胞，此后每3d換液一次。培養(yǎng)至第7d的細(xì)胞作Dil-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色，并用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面CD133、CD34、VEGFR-2、VE-cadherin、E-selectin、vWF的表達(dá)情況，透射電鏡觀察胞質(zhì)內(nèi)Weibel-Palade小體的分布，體外血管生成實驗檢測EPCs的管腔形成能力。

5、　　 2.活血化瘀中藥活性成分對EPCs數(shù)量和功能的影響
　　 取培養(yǎng)7-10d的EPCs用于研究，隨機(jī)分為兩組：正常對照組和藥物干預(yù)組。不同濃度的藥物活性成分銀杏內(nèi)酯B、西紅花苷-Ⅰ、二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯、薯蕷皂苷分別孵育EPCs48h后，采用WST-8比色法、Transwell小室法、粘附能力測定實驗、體外血管生成實驗檢測細(xì)胞增殖能力、遷移能力、粘附能力、管腔形成能力。
　　 3.銀杏內(nèi)酯B對H2O2誘導(dǎo)的EPCs

6、的氧化損傷的保護(hù)作用及促進(jìn)EPCs數(shù)量和功能的機(jī)制研究
　　 向銀杏內(nèi)酯B預(yù)先孵育24h的EPCs中加入150μMH2O2，未加藥物孵育的EPCs作為空白對照組，作用6h后，WST-8比色法檢測細(xì)胞增殖情況，AnnexinV/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡比例。
　　 應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY294002和Wortmannin以及Erk特異性抑制劑PD98059干預(yù)EPCs后，觀察其增殖情況。蛋白印跡法測定藥物干預(yù)對EPCs中

7、磷酸化蛋白Akt、eNOS表達(dá)的影響，實時熒光定量法觀察藥物干預(yù)對EPCs中mRNAeNOS、KDR表達(dá)水平的影響。統(tǒng)計方法采用配對t檢驗，獨立樣本的T檢驗，單因素方差分析，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件完成，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.人骨髓來源EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 原代細(xì)胞培養(yǎng)5d左右始見細(xì)胞集落形成，至第7d，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞伸展呈紡錘形?？蓴z取Dil-ac-LDL并

8、與FITC-UEA-Ⅰ結(jié)合。培養(yǎng)至第7d的細(xì)胞部分表達(dá)CD133、CD34、KDR，至第14d細(xì)胞表面CD133表達(dá)率下降，而相應(yīng)成熟內(nèi)皮細(xì)胞抗原KDR、VE-cadherin、E-selectin、vWF表達(dá)增加。透射電鏡結(jié)果顯示培養(yǎng)第10d的EPCs在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有血管內(nèi)皮細(xì)胞所特有的Weibel-Palade小體。培養(yǎng)第7-12d的EPCs接種于ECMatrix上，12h可形成管腔樣結(jié)構(gòu)。
　　 2.活血化瘀類中藥活性成分對

9、EPCs數(shù)量和功能的影響
　　 不同濃度銀杏內(nèi)酯B與EPCs培養(yǎng)48 h能較對照組明顯提高EPCs數(shù)量，顯著改善其遷移、黏附、體外血管形成能力；不同濃度西紅花苷-Ⅰ作用48h后，5μg/mL、50μg/mL西紅花苷-Ⅰ可明顯促進(jìn)EPC增殖，改善EPCs的粘附能力和遷移能力；不同濃度二氫歐山芹醇當(dāng)歸酸酯作用48h后，可明顯促進(jìn)EPCs增殖(P＜0.05)，呈濃度依賴性，但對細(xì)胞的遷移能力無明顯影響；不同濃度薯蕷皂苷作用24、48h

10、后，對EPCs的增殖能力無影響。
　　 3.銀杏內(nèi)酯B對H2O2誘導(dǎo)的EPCs的氧化損傷的保護(hù)作用及促進(jìn)EPCs數(shù)量和功能的機(jī)制研究
　　 不同濃度銀杏內(nèi)酯B能顯著提高細(xì)胞存活率，并有效減少H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。不同濃度MAPK/ERK-1、Akt信號通路抑制劑PD98059、LY294002、Wortmaning與EPCs作用48h，未降低細(xì)胞活性。上述信號通路抑制劑對80μg/mI銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)的EPCs的增殖有抑

11、制作用，其中1μMPD98059及10μM、100μMPD98059、LY294002、 Wortmaning與對照組比較有顯著差異。銀杏內(nèi)酯B提高了EPCs中Akt、eNOS的蛋白表達(dá)和eNOS、KDR的mRNA表達(dá)，且呈一定的濃度依賴性。
　　 結(jié)論:
　　 采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)的人骨髓來源的單個核細(xì)胞，通過特定誘導(dǎo)條件下可分化為EPCs。活血化瘀類中藥活性成分銀杏內(nèi)酯B可促進(jìn)EPCs增殖，增強(qiáng)細(xì)胞