活血化瘀中藥活性成分對內皮祖細胞的作用與機理研究.pdf

1、目的:
　　 內皮祖細胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管內皮細胞(endothelialcells，ECs)的前體細胞，是一群介于血液-血管細胞與成熟內皮細胞之間的具有較強增殖分化能力、可向血管新生部位趨化并促進血管新生的幼稚細胞。在成人，EPCs存在于骨髓，在機體缺血、組織損傷、細胞因子或藥物刺激下，可從骨髓向靶部位動員、歸巢、分化，形成新生血管，在臨床各種缺血性疾病和血管損傷方面有

2、著廣泛的應用前景。
　　 腰椎間盤退變性疾病因其高發(fā)病率和高致殘率，嚴重危害人體健康，造成了沉重的社會負擔。椎間盤內無血管組織，其營養(yǎng)來源于經軟骨終板和纖維環(huán)的滲透作用。終板血供異常可影響椎間盤基質代謝，促使椎間盤退變。將骨髓來源的EPCs移植至腰椎間盤終板周圍可能對腰椎間盤退變病人終板下微循環(huán)的重建具有重要作用。據(jù)文獻報道，益氣活血化瘀中藥可通過改善終板血液循環(huán)以增加椎間盤營養(yǎng)供應，調節(jié)椎間盤細胞外基質的結構和功能，抑制椎間盤

3、炎癥介質，但該類中藥如何改善終板血液循環(huán)尚未見明確報道。
　　 本研究通過建立人骨髓來源EPCs分離、培養(yǎng)、誘導分化與鑒定的方法，篩選出對EPCs數(shù)量和功能有促進作用的中藥活性成分，并探討其作用機制，為腰椎間盤退變性疾病的發(fā)病機理及其預防治療的研究提供實驗基礎。
　　 方法:
　　 1.人骨髓來源EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 采用Ficoll密度梯度離心法，分離腰椎間盤退變性疾病患者骨髓中的單個核細胞

4、，以3 x106/cm2/密度接種于預先包被人纖維連接蛋白的25cm2培養(yǎng)瓶中，72h后換液，洗去非貼壁細胞，此后每3d換液一次。培養(yǎng)至第7d的細胞作Dil-ac-LDL和FITC-UEA-Ⅰ雙熒光染色，并用流式細胞儀分析細胞表面CD133、CD34、VEGFR-2、VE-cadherin、E-selectin、vWF的表達情況，透射電鏡觀察胞質內Weibel-Palade小體的分布，體外血管生成實驗檢測EPCs的管腔形成能力。

5、　　 2.活血化瘀中藥活性成分對EPCs數(shù)量和功能的影響
　　 取培養(yǎng)7-10d的EPCs用于研究，隨機分為兩組：正常對照組和藥物干預組。不同濃度的藥物活性成分銀杏內酯B、西紅花苷-Ⅰ、二氫歐山芹醇當歸酸酯、薯蕷皂苷分別孵育EPCs48h后，采用WST-8比色法、Transwell小室法、粘附能力測定實驗、體外血管生成實驗檢測細胞增殖能力、遷移能力、粘附能力、管腔形成能力。
　　 3.銀杏內酯B對H2O2誘導的EPCs

6、的氧化損傷的保護作用及促進EPCs數(shù)量和功能的機制研究
　　 向銀杏內酯B預先孵育24h的EPCs中加入150μMH2O2，未加藥物孵育的EPCs作為空白對照組，作用6h后，WST-8比色法檢測細胞增殖情況，AnnexinV/PI雙染檢測細胞凋亡比例。
　　 應用PI3K特異性抑制劑LY294002和Wortmannin以及Erk特異性抑制劑PD98059干預EPCs后，觀察其增殖情況。蛋白印跡法測定藥物干預對EPCs中

7、磷酸化蛋白Akt、eNOS表達的影響，實時熒光定量法觀察藥物干預對EPCs中mRNAeNOS、KDR表達水平的影響。統(tǒng)計方法采用配對t檢驗，獨立樣本的T檢驗，單因素方差分析，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件完成，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.人骨髓來源EPCs的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　 原代細胞培養(yǎng)5d左右始見細胞集落形成，至第7d，細胞體積變大，細胞伸展呈紡錘形?？蓴z取Dil-ac-LDL并

8、與FITC-UEA-Ⅰ結合。培養(yǎng)至第7d的細胞部分表達CD133、CD34、KDR，至第14d細胞表面CD133表達率下降，而相應成熟內皮細胞抗原KDR、VE-cadherin、E-selectin、vWF表達增加。透射電鏡結果顯示培養(yǎng)第10d的EPCs在細胞質內含有血管內皮細胞所特有的Weibel-Palade小體。培養(yǎng)第7-12d的EPCs接種于ECMatrix上，12h可形成管腔樣結構。
　　 2.活血化瘀類中藥活性成分對

9、EPCs數(shù)量和功能的影響
　　 不同濃度銀杏內酯B與EPCs培養(yǎng)48 h能較對照組明顯提高EPCs數(shù)量，顯著改善其遷移、黏附、體外血管形成能力；不同濃度西紅花苷-Ⅰ作用48h后，5μg/mL、50μg/mL西紅花苷-Ⅰ可明顯促進EPC增殖，改善EPCs的粘附能力和遷移能力；不同濃度二氫歐山芹醇當歸酸酯作用48h后，可明顯促進EPCs增殖(P＜0.05)，呈濃度依賴性，但對細胞的遷移能力無明顯影響；不同濃度薯蕷皂苷作用24、48h

10、后，對EPCs的增殖能力無影響。
　　 3.銀杏內酯B對H2O2誘導的EPCs的氧化損傷的保護作用及促進EPCs數(shù)量和功能的機制研究
　　 不同濃度銀杏內酯B能顯著提高細胞存活率，并有效減少H2O2誘導的細胞凋亡。不同濃度MAPK/ERK-1、Akt信號通路抑制劑PD98059、LY294002、Wortmaning與EPCs作用48h，未降低細胞活性。上述信號通路抑制劑對80μg/mI銀杏內酯B誘導的EPCs的增殖有抑

11、制作用，其中1μMPD98059及10μM、100μMPD98059、LY294002、 Wortmaning與對照組比較有顯著差異。銀杏內酯B提高了EPCs中Akt、eNOS的蛋白表達和eNOS、KDR的mRNA表達，且呈一定的濃度依賴性。
　　 結論:
　　 采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)法分離、培養(yǎng)的人骨髓來源的單個核細胞，通過特定誘導條件下可分化為EPCs?；钛鲱愔兴幓钚猿煞帚y杏內酯B可促進EPCs增殖，增強細胞