生物傳感技術(shù)對活血化瘀中藥有效成分作用機(jī)理的研究.pdf

1、親和型生物傳感器以其靈敏度高、響應(yīng)快、特異性強(qiáng)、樣品無需標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)越來越受到研究者的重視。本論文主要研究工作是通過不同的表面修飾技術(shù)，利用親和型生物傳感器構(gòu)建了可應(yīng)用于基于細(xì)胞因子和受體相互作用的中藥有效成分作用機(jī)理研究的親和型生物傳感技術(shù)，并將其應(yīng)用于活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機(jī)理的研究中。論文的主要內(nèi)容概括如下： 1.可應(yīng)用于中藥有效成分作用機(jī)理研究的親和型生物傳感技術(shù)——IAsys和QCM生物傳感技術(shù)的構(gòu)建及其在赤

2、芍801作用機(jī)理研究中應(yīng)用的可行性和可信性。 利用生物素-親和素系統(tǒng)和自組裝膜技術(shù)，將sTNFR-I固定于IAsys樣品池和QCM基片表面，結(jié)合IAsys和QCM兩種親和型生物傳感器，檢測sTNFR-I與TNF-α的特異性相互作用，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了可應(yīng)用于基于細(xì)胞因子和受體相互作用的中藥有效成分作用機(jī)理研究的親和型生物傳感技術(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：兩種方法均可有效地將sTNFR-I固定在傳感器的敏感表面上，而且sTNFR-I在樣品池表

3、面的固定化效果與sTNFR-I溶液濃度相關(guān)，12mg/L是sTNFR-I在IAsys樣品池和QCM基片表面固定化的最適濃度。TNF-α可與固定于IAsys樣品池和QCM基片表面的sTNFR-I發(fā)生特異性結(jié)合。重復(fù)性和可信性實(shí)驗(yàn)表明：構(gòu)建的IAsys和QCM兩種親和型生物傳感技術(shù)在TNF-α與sTNFR-I特異性相互作用研究中的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)分別是2.12％和5.76％。證明該方法可以應(yīng)用于基于細(xì)胞因子和受體相互作用的中藥有效成分作

4、用機(jī)理研究，而且具有很高的可行性和可信性。 2.IAsys和QCM生物傳感技術(shù)對活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機(jī)理的研究。 應(yīng)用構(gòu)建的IAsys和QCM兩種親和型生物傳感技術(shù)對TNF-α和sTNFR-I之間的特異性相互作用進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測，對TNF-α和sTNFR-I之間相互作用的動力學(xué)進(jìn)行分析，并在此基礎(chǔ)上研究赤芍801、阿魏酸和川芎嗪對TNF-α和sTNFR-I相互作用的影響，以探討赤芍801的體內(nèi)靶點(diǎn)和作用機(jī)理。實(shí)

5、驗(yàn)結(jié)果表明：TNF-α可與固定于樣品池表面的sTNFR-I發(fā)生濃度依賴性、特異性、快速結(jié)合，并經(jīng)FASTfit分析，計算反應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，親和常數(shù)KD=～10-7M，KA=～106M-1。赤芍801可增強(qiáng)其相互作用，增加TNF-α和sTNFR-I的親和力，使其相互作用的親和常數(shù)KD由～10-7M提高至～10-8M。并具有濃度依賴性。揭示了TNF-α與sTNFR-I的相互作用可能是赤芍801發(fā)揮其藥理學(xué)作用的體內(nèi)調(diào)控靶點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還證

6、明：阿魏酸和川芎嗪對TNF-α和sTNFR-I之間的結(jié)合反應(yīng)無明顯影響。分別將應(yīng)用兩種不同的表面修飾技術(shù)構(gòu)建的IAsys和QCM生物傳感技術(shù)應(yīng)用于赤芍801作用機(jī)理的研究，不僅成功地完成了對TNF-α和sTNFR-I相互作用的實(shí)時監(jiān)測和動力學(xué)分析，且兩種方法取得了高度一致性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，更進(jìn)一步證實(shí)了該方法的科學(xué)性和可靠性。 對傳感器敏感表面的再生及使用壽命進(jìn)行了研究，TNF-α結(jié)合至表面后可用10mMHCl洗脫其與sTNFR-I

7、的結(jié)合，再生得到sTNFR-I包被的樣品池表面，可重復(fù)使用。且生物素樣品池還可用飽和KOH洗脫其表面結(jié)合的全部蛋白，用于不用的實(shí)驗(yàn)觀察。通過再生，樣品池可重復(fù)利用，降低成本。樣品池在包被配基后一周內(nèi)可保持較高的配體結(jié)合活性，可用于長期檢測。 3.IAsys和QCM生物傳感技術(shù)在活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機(jī)理研究中的比較 應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)和自組裝膜表面修飾技術(shù)均可有效將sTNFR-I固定于傳感器敏感表面以用于

8、與TNF-α的相互作用分析。且兩種修飾方法在傳感器敏感表面固定sTNFR-I的量，在sTNFR-I溶液濃度相同時差異很小。CMD樣品池由于不需要預(yù)先將sTNFR-I進(jìn)行生物素標(biāo)記處理等，從而簡化了操作。且能達(dá)到應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)同樣的固定sTNFR-I的效果。但由于通過CMD表面的羧基與蛋白的氨基鍵合而將蛋白質(zhì)配基固定于樣品池表面，以固定的配基難于在不破壞CMD表面的情況下徹底洗脫，因而不能再用于固定不同的配基；而生物素樣品池在使用

9、中由于配基蛋白質(zhì)不直接與樣品池表面結(jié)合，在一定條件下可以被洗脫。因此同一生物素樣品池可以重復(fù)利用，用于固定不用的配基蛋白。 在實(shí)際應(yīng)用中，QCM和IAsys均具有較高的重復(fù)性，QCM對144nMTNF-α與sTNFR-I的結(jié)合5次重復(fù)檢測的RSD=5.76％和8.56％，IAsys對144nMTNF-α與sTNFR-I的結(jié)合5次重復(fù)檢測的RSD=2.12％和1.49％，說明IAsys檢測的重復(fù)性優(yōu)于QCM。且由于檢測原理的不同，

10、IAsys檢測的響應(yīng)速度比QCM更快。 本研究以臨床常用及現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí)的有效的活血化瘀中藥有效成分赤芍801等作為切入點(diǎn)，應(yīng)用不同的表面修飾技術(shù)，結(jié)合IAsys和QCM生物傳感技術(shù)構(gòu)建了一種可應(yīng)用于基于TNF-α和sTNFR-I相互作用的中藥有效成分作用機(jī)理研究的簡單、快速、可靠的研究方法，并將其應(yīng)用于活血化瘀中藥有效成分赤芍801作用機(jī)理的研究中。不僅有助于闡明TNF-α/sTNFR-I的生物學(xué)意義和活血化瘀中藥有效成分