人類卵巢組織超低溫冷凍保存和應(yīng)用的初步探索.pdf

1、第一部份人類卵巢組織超低溫冷凍保存的研究。 [目的]旨在初步建立人類卵巢組織冷凍保存慢速冷凍和玻璃化冷凍方法，并且比較兩者的效果。同時觀察新鮮和解凍卵巢組織的某些生理特點。 [方法] 1.收集人類卵巢組織供冷凍及下游相關(guān)技術(shù)研究2.研究建立人類卵巢組織的超低溫冷凍保存方案a) 建立人類卵巢組織慢速程序化方法冷凍的方法b) 探索人類卵巢組織玻璃化冷凍方法的可行性c) 比較上述兩種冷凍方法解凍后卵巢組織中卵泡的存活率

2、、啟動生長情況和內(nèi)分泌功能。d) 熒光染色的方法觀察解凍后卵巢組織的存活和壞死情況。e) 免疫組化方法觀察卵巢組織中Ki-67、MMP-9、總Caspase-3和活性Caspase-3的表達f) 原位雜交TUNEL方法檢測卵巢組織中凋亡信號。 2.體外培養(yǎng)后，兩組中有活力的卵巢組織小粒慢慢變成圓形。卵泡形態(tài)正常率在兩冷凍組間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.952)。與新鮮組織相比，冷凍組織2周培養(yǎng)后，兩組培養(yǎng)后的組織中的初級卵泡比例

3、都顯著性的增加(P<0.001)。而兩培養(yǎng)組間差異不明顯(P=0.908)。結(jié)果提示人卵泡能經(jīng)受這兩種凍融方法，并且能夠在體外培養(yǎng)系統(tǒng)中啟動生長。 3.在體外培養(yǎng)2周中，培養(yǎng)液平均雌二醇和孕酮水平不斷增高(P<0.001)，同期組間雌二醇和孕酮濃度差別無統(tǒng)計學意義(P=0.96和0.93)。 4.使用Calcein AM。和Ethidium homodimer-Ⅰ熒光分析顯示，解凍后大部分組織顯示為綠色熒光，表明是存活的

4、；小部分組織出現(xiàn)了紅色區(qū)域，此為壞死區(qū)域。另外，只要厚度切得合適，在相差顯微鏡下是可以直接觀察到組織條塊上卵泡數(shù)量的。 5.總Caspase-3免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，在新鮮和凍融組織所有類型的卵泡，各級顆粒細胞胞漿中都可有陽性的表達。卵泡膜細胞、卵子和卵巢組織間質(zhì)中也有一定程度的表達。 6.進行Active Caspase-3免疫組化和TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，人類卵巢組織中除竇卵泡外，其它各級卵泡中都是陰性表達。在卵巢組織間質(zhì)常

5、有有散在陽性細胞。 7.不同厚度(0.25mm、0.5mm、1mm)卵巢組織的慢速冷凍效果相似。 第二部分人類卵巢組織異種移植的初步研究。 [目的]探索卵巢組織皮下移植的方法，建立常規(guī)的卵巢組織皮下移植技術(shù)；觀察卵巢組織在不同性別、去勢與否以及不同局部環(huán)境下，人類卵巢組織的生長情況長期效果。 [方法] 1.進行小鼠卵巢組織自體皮下移植，觀察移植后卵泡生長情況。 2.進行解凍后人類卵巢組織的

6、SCID小鼠異種移植，觀察凍融后人類卵巢組織移植1、4、8、10周后卵泡的生長情況。 [結(jié)果] 1.經(jīng)過10周的異位生長并進行PMSG超排卵后，可以獲得小鼠竇卵泡和卵子。但是異位移植卵巢組織中的各級卵泡與正常原位卵巢相比明顯減少，幾乎殆盡。 2.移植第一周時，許多新生血管已經(jīng)向卵巢組織間延伸，與人類卵巢組織自然生理血液供應(yīng)有明顯組織解剖學上的差別。 3.各組原始卵泡存活率與解凍后未移植組織相比明顯下降(P

7、<0.05)。六組間比較，移植后第一周原始卵泡形態(tài)正常率差別有統(tǒng)計學意義(P=0.046)，無菌創(chuàng)傷雄性小鼠組最高(64.6﹪)，完整雌性小鼠組最低(39.7﹪)。三組雄性小鼠間比較，第五組最高(64.6﹪)；三組雌性小鼠間比較，第六組最高(63.4﹪)。性別差異比較中，原始卵泡形態(tài)正常率相比差別無統(tǒng)計學意義。去勢影響中，原始卵泡形態(tài)正常率差別亦無統(tǒng)計學意義。 4.異種移植的10周中，隨移植時間推移，生長期的卵泡百分比明顯增加，

8、各p值均小于0.05。而各處理組間相比，不同時間點差別都沒有統(tǒng)計學意義，各P值均大于0.05。 5.結(jié)果顯示，Ki-67在細胞的核中表達為主。在解凍和移植后組織中，MMP-9在細胞漿中表達為主。移植后組織中的Ki-67表達分布規(guī)律與解凍組織相似，而MMP-9的表達在間質(zhì)中顯得更加廣泛。 6.異種移植1周人類卵巢組織各級卵泡TUNEL原位雜交分析，除檢測到竇卵泡顆粒細胞和卵泡膜細胞中有陽性表達外，其它類型卵泡中未見有陽性表

9、達細胞。在卵巢組織問質(zhì)常有有散在的陽性細胞。 7.經(jīng)過17周的SCID小鼠異種移植后，在沒有使用外源促性腺激素的情況下，有肉眼可見小竇卵泡形成。 第三部分人類卵巢組織體外培養(yǎng)的初步研究。 [目的]建立我們的卵巢組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)，探索解凍后人類卵巢組織在不同ECM中的生長情況以及雄激素、胰島素對卵泡長期體外生長的影響。 [方法] 1.探索建立Matrigel和低熔點瓊脂的卵巢組織體外培養(yǎng)系統(tǒng)2.分組

10、觀察雄激素和高濃度胰島素在上述兩種系統(tǒng)中的生長情況a)組織學方法比較各組培養(yǎng)中卵泡在第1、4、8、12周的存活率b)組織學方法比較各組培養(yǎng)中卵泡在第1、4、8、12周的生長率c)放射免疫檢測比較各組培養(yǎng)后培養(yǎng)液中雌二醇、孕酮及其比值在第1、3、5、7、9、11周的分泌情況d)酶聯(lián)免疫方法檢測比較各組培養(yǎng)后培養(yǎng)液中hMMP-9在第2、4、6、8、10、12周的分泌情況e)免疫組化方法檢測培養(yǎng)后各組Ki-67、MMP-9的表達情況f) 免疫

11、組化方法檢測各組培養(yǎng)一周后活性Caspase-3表達情況[結(jié)果]1.卵巢組織在培養(yǎng)后，其邊緣逐漸鈍化，整個組織邊緣變得鈍化，逐漸向圓形過渡。 2.在此研究中共對830個卵泡進行了分析。在進行了12周的體外培養(yǎng)后，盡管卵泡不斷的閉鎖，但仍然有部分保持形態(tài)學上相對正常的狀態(tài)。 3.在第一周培養(yǎng)中，組間總體卵泡存活率(TFSR)差別有統(tǒng)計學意義(P=0.017)。A2組最高(72.7﹪)，D2組最低(43.3﹪)。兩兩對比分析

12、發(fā)現(xiàn)，D1組和A2、C1組問有顯著性差異(P<0.05)；D2組和A2、C1組間亦有顯著性差異(P<0.05)。在此后的第4、8和12周體外培養(yǎng)中組間TFSR差別不明顯(All P>0.05)。而各組分別在第1、4、8、12周體外生長中TFSR分析發(fā)現(xiàn)，除D2組的周問差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026，第1周最低，12周最高)外，其它各組周讓差別不明顯。 4.在人類卵巢組織體外生長的12周期間，各組的原始卵泡能迅速啟動生長。體外培

13、養(yǎng)一周以后，與解凍卵巢組織相比，卵泡生長池率差異有統(tǒng)計學意義(All P<0.05)。而各組、各時間點生長池卵泡率差別不明顯(All P>0.05)。在培養(yǎng)12周收集的標本中偶見有竇腔的卵泡。 5.與未培養(yǎng)卵巢組織中的卵泡相對比，次級卵泡和類竇卵泡的顆粒細胞有明顯的形態(tài)學上差別。培養(yǎng)后顆粒細胞顯得明顯肥大，出現(xiàn)更卵子與顆粒細胞生長不同步的現(xiàn)象。而卵巢組織間質(zhì)在培養(yǎng)后，其解剖構(gòu)型未見明顯改變。 6.結(jié)果顯示，Ki-67在細

14、胞的核中表達為主。在解凍和移植后組織中，MMP-9在細胞漿中表達為主。培養(yǎng)后組織中的Ki-67表達分布規(guī)律與解凍組織相似，而MMP-9的表達在間質(zhì)中顯得更加廣泛。 7.在進行Active Caspase-3免疫組化的切片中發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)1周人類卵巢組織中所有的原始卵泡、初級卵泡以及次級卵泡中各組成細胞是陰性表達的。未見有竇卵泡。在卵巢組織間質(zhì)常有有散在的陽性細胞。 8.在進行卵巢組織體外培養(yǎng)后，雌激素在同組各標本間分泌量

15、相差較大。進行三因素析因統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液成份和培養(yǎng)時間對雌二醇分泌與雌孕激素比值有影響。雄激素和高濃度胰島素共同添加組最高；在第9周分泌量最多。培養(yǎng)時間對孕激素分泌有影響，第10周分泌量最多。 9.在進行卵巢組織體外培養(yǎng)后，對MMP-9分泌量進行三因素析因統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，鋪膠、培養(yǎng)液成份和周數(shù)對MMP-9分泌量都無影響。交互影響因素分析發(fā)現(xiàn)，鋪膠組&培養(yǎng)組、鋪膠組&周數(shù)對MMP-9分泌量分泌有影響(P<0.001和P=

16、0.684)。 [結(jié)論] 1.慢速程序化冷凍和玻璃化冷凍方法都能較好地凍存人類卵巢組織，解凍組織保持一定活性，可應(yīng)用于人類卵巢組織的超低溫冷凍保存。 2.推測早期卵泡閉鎖并不是凋亡；卵巢組織間質(zhì)和竇卵泡才可以發(fā)生細胞凋亡。 3.卵巢組織冷凍前預(yù)處理中，厚度在0.25～1mm時，冷凍效果差別不明顯。 4.人類卵巢組織異種皮下移植方法是可行的；宿主性別和去勢情況對10周移植效果影響不大，局部無菌性創(chuàng)口

17、可改善卵泡存活率。 5.卵巢組織異種皮下移植和體外培養(yǎng)情況下，與與生理情況下的卵巢組織有不同生長特點。 6.兩種人類卵巢組織培養(yǎng)系統(tǒng)都可以維持組織的長期體外生長；低膠點瓊脂培養(yǎng)系統(tǒng)可適合更細致的培養(yǎng)因素觀察。 7.MMP-9在卵巢組織中廣泛表達，并以顆粒細胞表達最高；在培養(yǎng)液中可以檢測到MMP-9分泌，將來應(yīng)可以作為體外培養(yǎng)中卵巢組織總體活性評價的一項指標。 8.鋪膠和培養(yǎng)液成份間可能存在交互作用。