石蒜的組織培養(yǎng)及超低溫保存技術(shù)初步研究.pdf

1、石蒜（Lycoris spp.）為主產(chǎn)我國(guó)的著名觀賞及藥用植物，近年來(lái)存在種質(zhì)資源破壞嚴(yán)重，收集、保存與育種相對(duì)滯后的問(wèn)題。組織培養(yǎng)不僅是快速繁殖的有效方法，同時(shí)也是種質(zhì)保存（超低溫保存）及創(chuàng)新的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以紅花石蒜為代表樣本，對(duì)其鱗莖及生長(zhǎng)點(diǎn)的組織培養(yǎng)進(jìn)行研究。同時(shí)，對(duì)石蒜屬植物6個(gè)類(lèi)群的鱗莖組織培養(yǎng)及紅花石蒜其它器官的組織培養(yǎng)進(jìn)行探索。 除對(duì)原生地進(jìn)行保護(hù)，建立種質(zhì)資源圃外，超低溫（-196℃）保存是目前種質(zhì)保存最為長(zhǎng)期穩(wěn)

2、定和經(jīng)濟(jì)的選擇。近年發(fā)展的玻璃化超低溫保存技術(shù)因其簡(jiǎn)易有效，正被廣泛使用。本試驗(yàn)采用玻璃化法試圖建立紅花石蒜莖尖的超低溫保存技術(shù)體系，得到再生植株，為長(zhǎng)期保存石蒜及鱗莖類(lèi)植物的種質(zhì)資源提供參考。主要結(jié)果如下： ·石蒜組織培養(yǎng)研究 以紅花石蒜（Lycoris radiata）的鱗莖切塊及生長(zhǎng)點(diǎn)為材料，采用不同激素配比的MS培養(yǎng)基，對(duì)離體小鱗莖的分化和增殖進(jìn)行研究。其中BA 3mg／L及NAA 1.5mg／L的培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率

3、最高，可達(dá)53％，誘導(dǎo)生成的小植株強(qiáng)健整齊，為超低溫保存研究提供適用小鱗莖2000多株。 石蒜生長(zhǎng)點(diǎn)在含不同激素的培養(yǎng)基上可形成3種不同類(lèi)型的愈傷組織，其中在2,4-D 2mg／L、BA 0.5mg／L及在NAA 3mg／L、BA 3mg／L的培養(yǎng)基上，有胚性愈傷組織產(chǎn)生，轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基可再生植株，應(yīng)是進(jìn)行超低溫保存的理想材料。 以紅花石蒜為模式植物，對(duì)中國(guó)石蒜、換錦花、白花石蒜、江蘇石蒜、稻草石蒜、忽地笑等6種石蒜屬不

4、同類(lèi)群的鱗莖進(jìn)行組織培養(yǎng)。除忽地笑外，其它均可誘導(dǎo)出芽或小鱗莖，進(jìn)一步為石蒜屬資源的超低溫保存平臺(tái)創(chuàng)造了條件。 對(duì)紅花石蒜其它器官如葉片、花絲、花藥及種子或幼胚的組織培養(yǎng)進(jìn)行探索，前期均可誘導(dǎo)出愈傷組織，其中種子及幼葉有再生植株產(chǎn)生。 ·紅花石蒜莖尖玻璃化超低溫保存技術(shù)研究 切取直徑1-5 mm不同大小的紅花石蒜莖尖進(jìn)行玻璃化超低溫保存，其中2-3mm的石蒜莖尖成活率最高（80％-90％）。莖尖的完整性對(duì)成活率及

5、再生率均有影響，帶根芽原基的莖尖組織在恢復(fù)培養(yǎng)時(shí)可同時(shí)發(fā)根長(zhǎng)芽，長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)。 對(duì)比預(yù)培養(yǎng)環(huán)節(jié)中不同濃度蔗糖及不同預(yù)培養(yǎng)天數(shù)對(duì)成活率的影響，結(jié)果顯示蔗糖濃度為0.4 mol／L培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3d時(shí)，莖尖成活率最高，達(dá)80％；而當(dāng)蔗糖濃度為0.7mol／L時(shí)，莖尖水漬化不易操作，成活率下降為21％。在1.7d的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，以預(yù)培養(yǎng)5d效果最好，成活率達(dá)90％。 采用直徑2-3mm的石蒜莖尖在蔗糖濃度為0.4mol／L的MS培養(yǎng)

6、基預(yù)培養(yǎng)5d，用預(yù)處理液處理20min，再經(jīng)PVS2（0℃）分別處理30min、60min、80min、120min、150min?；謴?fù)培養(yǎng)結(jié)果表明：處理時(shí)間少于30min，由于保護(hù)劑處理時(shí)間過(guò)短，材料脫水不夠，不能成活，隨時(shí)間延長(zhǎng)成活率上升，到80min時(shí)成活率可達(dá)最高90％，后又下降。 解凍后莖尖轉(zhuǎn)移至恢復(fù)培養(yǎng)基，5-7d后可通過(guò)顏色變化，肉眼鑒別是否成活。約14-28d后便可見(jiàn)有恢復(fù)生長(zhǎng)，莖尖不經(jīng)愈傷組織直接再生，再生率可

7、達(dá)53％。 據(jù)此，我們得出玻璃化法保存石蒜莖尖的優(yōu)化程序?yàn)椋?-3mm的石蒜莖尖在MS+0.4mol／L蔗糖的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)5d，在25℃下經(jīng)預(yù)處理液處理20min，再于0℃下用PVS2處理80min后，換入新鮮PVS2并迅速投入液氮。24h后，在40℃水浴中快速化凍2min，用MS+1.2mol／L蔗糖液體培養(yǎng)基洗滌20min，濾紙吸干后接種到恢復(fù)培養(yǎng)基中，暗培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)入正常光培養(yǎng)。 超低溫保存中活力及遺傳穩(wěn)定性研究