南極冰藻CPD光修復(fù)酶基因的真核表達(dá)及其紫外線輻射損傷修復(fù)功能研究.pdf

1、南北極巨大臭氧空洞的出現(xiàn)，使得到達(dá)地表的紫外線輻射增強(qiáng)，對(duì)人類健康和自然生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響。紫外線輻射主要損害是在 DNA中形成嘧啶二聚體（CPDs）和6-4光產(chǎn)物（6-4）PPs，它們阻礙了DNA的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致DNA的紫外輻射損傷，具有致突變、致癌變和致死等效應(yīng)。DNA光修復(fù)酶承擔(dān)修復(fù) DNA損傷并保持生物遺傳穩(wěn)定性的重要功能，根據(jù)其作用底物的不同可以分為CPD光修復(fù)酶和（6-4）光修復(fù)酶；這兩種酶的作用機(jī)理相似，但一種酶只能修

2、復(fù)一種損傷而不能修復(fù)另外一種。由于紫外線輻射產(chǎn)生的 CPDs和（6-4）PPs分別為80-90%和10-20%，目前對(duì)光修復(fù)酶的研究多集中在CPD光修復(fù)酶。哺乳動(dòng)物（包括人類）缺少光修復(fù)系統(tǒng)，已有研究表明低等生物的光修復(fù)酶對(duì)人體的 DNA修復(fù)同樣有效。南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L能在強(qiáng)紫外輻射環(huán)境中生存，其DNA光修復(fù)酶應(yīng)具有較強(qiáng)的生物活性。本文主要開(kāi)展南極冰藻CPD光修復(fù)酶基因的真核表達(dá)及其紫外線輻射損傷修復(fù)

3、功能研究，以期為南極冰藻光修復(fù)酶應(yīng)用于紫外線損傷修復(fù)及其相關(guān)疾病防治提供可靠科學(xué)依據(jù)。
　　目的：
　　通過(guò)本研究，認(rèn)識(shí)南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L在UV-B輻射條件下的生長(zhǎng)特性，構(gòu)建南極冰藻CPD光修復(fù)酶的真核表達(dá)體系，進(jìn)行高效表達(dá)，并分離純化南極冰藻 CPD光修復(fù)酶，研究其體內(nèi)和體外生物學(xué)活性；同時(shí)探索南極冰藻 CPD光修復(fù)酶活性中心位點(diǎn)的功能，在細(xì)胞和動(dòng)物體水平研究南極冰藻CPD光修復(fù)酶對(duì)紫外

4、線輻射損傷的修復(fù)功能。
　　方法：
　　1.利用分光光度計(jì)測(cè)定南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L在UV-B輻射條件下的生長(zhǎng)曲線，并測(cè)定其活性氧自由基的產(chǎn)生速率和丙二醛含量；同時(shí)分別采用鄰苯三酚自氧化法、愈傷木酚法和分光光度法測(cè)定南極冰藻超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性。
　　2.利用PCR克隆南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶全長(zhǎng)基因，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證；然后

5、構(gòu)建真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化、篩選陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行PCR檢測(cè)，獲得南極冰藻CPD光修復(fù)酶基因酵母工程菌。
　　3.利用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶基因酵母工程菌的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，利用鎳柱親和層析進(jìn)行分離純化；利用SDS-PAGE和Western blot對(duì)純化蛋白進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)純化蛋白進(jìn)行N’端測(cè)序驗(yàn)證。
　　4.通過(guò)計(jì)算南極冰藻Chlamydomonas sp.

6、 ICE-L CPD光修復(fù)酶基因酵母工程菌在紫外輻射環(huán)境中的存活率，檢測(cè)其耐紫外輻射功能，明確體內(nèi)修復(fù)活性；利用紫外吸收光譜法，體外檢測(cè)純化的南極冰藻CPD光修復(fù)酶修復(fù)嘧啶二聚體的活性。
　　5.利用點(diǎn)突變研究了南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶活性中心位點(diǎn)271R（精氨酸），323E（谷氨酸）和395M（甲硫氨酸）的功能；271R（精氨酸Arg）突變?yōu)镚（甘氨酸Gly），標(biāo)記為R271G；32

7、3E（谷氨酸Glu）突變?yōu)锳（丙氨酸Ala），標(biāo)記為E323A；395M（甲硫氨酸Met）突變?yōu)镮（異亮氨酸Ile），標(biāo)記為M395I。
　　6.實(shí)驗(yàn)分別設(shè)置對(duì)照組、紫外照射組、南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶預(yù)防組和治療組；利用細(xì)胞計(jì)數(shù)和 Transwell分別檢測(cè)人角膜上皮細(xì)胞系（HCEC）細(xì)胞的增殖和遷移作用；分別構(gòu)建小鼠角膜上皮損傷模型和小鼠皮膚紫外損傷模型，研究南極冰藻CPD光修復(fù)酶

8、的紫外輻射損傷修復(fù)功能。
　　結(jié)果：
　　1.紫外線輻射對(duì)南極冰藻的生長(zhǎng)具有抑制作用。在UV-B輻射條件下，南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L的生長(zhǎng)速度低于無(wú)紫外線輻射對(duì)照組的生長(zhǎng)速度；當(dāng)紫外輻射強(qiáng)度達(dá)到100μW·cm-2時(shí)，南極冰藻細(xì)胞密度逐漸降低，并完全消亡。在UV-B輻射環(huán)境的脅迫下，在較短時(shí)間內(nèi)南極冰藻細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，并導(dǎo)致南極冰藻中丙二醛含量的迅速提高；南極冰藻體內(nèi)的抗氧化酶體系

9、對(duì)UV-B輻射進(jìn)行快速的應(yīng)激反應(yīng)，提高抗氧化酶活性，消除活性氧自由基，使得UV-B輻射與體內(nèi)活性氧逐漸產(chǎn)消平衡，從而保護(hù)冰藻細(xì)胞不致受到傷害。
　　2.從南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L中成功克隆獲得CPD光修復(fù)的全長(zhǎng)基因，并將其在釀酒酵母中表達(dá)，成功構(gòu)建南極冰藻CPD光修復(fù)酶重組釀酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae-SCPD。
　　3.南極冰藻CPD光修復(fù)酶重組釀酒酵母Sac

10、charomyces cerevisiae-SCPD生長(zhǎng)0-2 h為遲緩期，2-10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到10 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，在24 h時(shí)仍保持較高的生物量；表達(dá)CPD光修復(fù)酶最適培養(yǎng)條件為溫度為20℃，pH值為7.0，NaCl濃度為1%，半乳糖濃度為0.5 mmol/L。分離純化了重組南極冰藻CPD光修復(fù)酶，其濃度為0.25 mg/mL；其N端序列為NH2-Pro-Lys-Arg-Thr-Gln（PKRTQ），與南極冰藻CPD光

11、修復(fù)酶理論N端氨基酸序列一致。
　　4.在未照射UV-B條件下，轉(zhuǎn)南極冰藻CPD光修復(fù)酶基因釀酒酵母S.cerevisiae-SCPD和轉(zhuǎn)空白載體釀酒酵母S.cerevisiae-NULL的存活率基本一致；在照射UV-B條件下，S.cerevisiae-SCPD的存活量顯著高于S.cerevisiae-NULL的存活量。寡鏈嘧啶核苷酸d(pT)16經(jīng)100μW/cm2 UV-B照射后，其A265值在照射1 h內(nèi)急劇降低，在照射時(shí)間

12、達(dá)到3 h后其A265達(dá)到恒定，表明寡鏈嘧啶核苷酸d(pT)16經(jīng)UV-B輻射形成嘧啶二聚體；然后加入南極冰藻CPD光修復(fù)酶后，A265值在20 min快速升高，在其后修復(fù)能力達(dá)到極限，在20-50 min，對(duì)嘧啶二聚體的修復(fù)沒(méi)有明顯升高。
　　5.南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶中R271（精氨酸）應(yīng)為FAD結(jié)合位點(diǎn)的組成氨基酸，R271G點(diǎn)突變的Chlamydomonas sp. ICE-

13、L CPD光修復(fù)酶活性降低；南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶中E323（谷氨酸Glu）屬于隱花色素蛋白組成氨基酸，且位于蛋白α螺旋結(jié)構(gòu)中，E323A點(diǎn)突變的Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶活性降低；M395（甲硫氨酸Met）位于南極冰藻CPD最大的α螺旋結(jié)構(gòu)中，該螺旋結(jié)構(gòu)與DNA的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)，M395I點(diǎn)突變的南極冰藻CPD光修復(fù)酶基本上失去活性。
　　6.與對(duì)

14、照組相比紫外線照射組HCEC細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，與紫外照射組相比，南極冰藻CPD光修復(fù)酶預(yù)防組和治療組的HCEC細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，且預(yù)防組與治療組HCEC細(xì)胞的數(shù)量無(wú)明顯變化；對(duì)照組相比，紫外線照射組HCEC細(xì)胞的遷移明顯減少，與紫外照射組相比，南極冰藻CPD光修復(fù)酶預(yù)防組和治療組的HCEC細(xì)胞的遷移明顯增加，且預(yù)防組和治療組HCEC細(xì)胞的遷移無(wú)明顯變化。與對(duì)照組相比，紫外線照射組小鼠角膜上皮缺損面積變大，與紫外線照射組相比，南極冰藻

15、CPD光修復(fù)酶預(yù)防組和治療組的小鼠角膜上皮缺損面積變小，且預(yù)防組相比和治療組小鼠角膜上皮缺損面積差異不大。對(duì)照組小鼠皮膚光滑，紅潤(rùn)，無(wú)皺褶；組織切片顯示皮膚表皮較薄，基底層細(xì)胞呈矮立方形，只有1-2層棘層細(xì)胞，顆粒層不明顯。紫外組小鼠皮膚粗糙，破損，有出血點(diǎn)；與對(duì)照組相比，紫外照射組小鼠皮膚表皮明顯變厚，細(xì)胞層數(shù)增加，其中基底層細(xì)胞呈高柱狀、排列緊密、可見(jiàn)大量核分裂相，棘層細(xì)胞約有5-6層，其外可見(jiàn)2-3層顆粒層細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)充滿大量嗜堿

16、性透明角質(zhì)顆粒，角質(zhì)層較對(duì)照組亦增厚。南極冰藻CPD光修復(fù)酶治療組小鼠皮膚略粗糙，基本無(wú)破損；組織切片顯示，與紫外照射組相比，表皮厚度明顯薄，細(xì)胞層數(shù)減少，基底層細(xì)胞呈立方形，排列整齊，極性好，核分裂像較照射組少見(jiàn)。
　　結(jié)論:
　　1.南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L對(duì)紫外輻射的適應(yīng)能力較強(qiáng)，但紫外線輻射對(duì)南極冰藻的生長(zhǎng)具有抑制作用，其抗氧化酶系統(tǒng)在南極冰藻適應(yīng)南極強(qiáng)輻射環(huán)境中起著重要的作用。

17、　　2.構(gòu)建了南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶基因的真核表達(dá)體系，使其在釀酒酵母中表達(dá)，獲得南極冰藻CPD光修復(fù)酶重組釀酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiae-SCPD，成功分離純化南極冰藻CPD光修復(fù)酶，并用N端測(cè)序加以驗(yàn)證。
　　3.南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶具有較強(qiáng)的體內(nèi)和體外活性，能提高重組釀酒酵母在UV-B輻射環(huán)境的存

18、活率，在體外可快速修復(fù)嘧啶二聚體。
　　4.南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶點(diǎn)突變對(duì)其活性影響較大；R271G突變可能對(duì)電子傳遞功能產(chǎn)生影響，E323A突變可能對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，M395I突變對(duì)酶與DNA的結(jié)合影響較大。
　　5.紫外照射抑制HECE細(xì)胞的增殖和遷移能力，而外源性南極冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L CPD光修復(fù)酶可促進(jìn)細(xì)胞的增殖能和遷移能力。紫外照射