Rspo1基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)小鼠腸上皮輻射損傷.pdf

1、隨著核工業(yè)的發(fā)展,核科學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及核恐怖襲擊的威脅,如何救治急性輻射損傷成為了當(dāng)今迫切的需求。腸道對電離輻射十分敏感,腸上皮結(jié)構(gòu)和功能受損是急性輻射性病難以救治的關(guān)鍵因素之一。腸隱窩干細(xì)胞及其干細(xì)胞龕遭受嚴(yán)重破壞,是腸隱窩-絨毛更新障礙的根本原因,是腸上皮結(jié)構(gòu)和功能放射性損傷的關(guān)鍵病理機(jī)制。因此,亟待根據(jù)急性放射性病病程中腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷的病理機(jī)理特點(diǎn),提出新型有效的針對性救治策略。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal st

2、em cells, MSCs)是一群來源于中胚層,異質(zhì)性很強(qiáng)的具有自我更新能力的多能干細(xì)胞,能分化為脂肪細(xì)胞,成骨細(xì)胞,軟骨細(xì)胞,肝細(xì)胞,神經(jīng)元細(xì)胞,肌細(xì)胞,上皮細(xì)胞等細(xì)胞。此后大量研究表明,間充質(zhì)干細(xì)胞可趨化至受傷發(fā)炎的部位,具備潛在的免疫調(diào)節(jié)能力,抗炎能力和營養(yǎng)作用,是組織工程,再生醫(yī)學(xué)和自身免疫性疾病治療的理想工具。新近發(fā)現(xiàn)的一種可溶性分子Rspo1(R-spondin1)可通過結(jié)合腸隱窩干細(xì)胞表面Lgr5和Lgr4的受體、競爭抑

3、制Wnt通路拮抗劑DKK1等機(jī)制,調(diào)節(jié)并增強(qiáng)活化Wnt/β-catenin信號,促進(jìn)腸隱窩干細(xì)胞增殖和分化。另外,人Rspo1可作用于小鼠腸隱窩干細(xì)胞,產(chǎn)生促增殖、分化和生存作用。本文建立了腸上皮輻射損傷小鼠模型并觀察了其損傷規(guī)律,通過基因轉(zhuǎn)染的方法構(gòu)建了一株穩(wěn)定表達(dá)人Rspo1分子的間充質(zhì)干細(xì)胞株并鑒定了其生物學(xué)活性,利用Rspo1基因轉(zhuǎn)染的間充質(zhì)干細(xì)胞株過繼輸注腸上皮輻射損傷小鼠,通過間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮的免疫調(diào)節(jié)作用與 Rspo1/β

4、-catenin途徑刺激腸隱窩干細(xì)胞增殖和分化的作用相聯(lián)合,修復(fù)腸隱窩-絨毛更新機(jī)制,以期為急性放射病的有效救治提供新思路。本研究分為三個部分：
　　第一部分：腸上皮輻射損傷小鼠模型的建立及病理損傷規(guī)律。
　　目的：建立腸上皮輻射損傷小鼠模型,觀察損傷病理變化規(guī)律。
　　方法：分別以10Gy、12Gy、14Gy、16Gy和18Gy劑量單純照射小鼠腹部,確定單純腹部照射的最小致輻射死劑量。進(jìn)而采用18Gy劑量照射 Lgr

5、5-EGFP-ires-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠,每日觀察小鼠體重,并在輻照后0.5 d、3.5 d和6 d取小鼠小腸,觀察小腸的病理學(xué)改變規(guī)律,如小腸絨毛長度、腸隱窩數(shù)目以及腸隱窩Lgr5+干細(xì)胞的數(shù)量變化。
　　結(jié)果：18Gy為單純腹部照射建立腸上皮輻射損傷小鼠模型的最小致死劑量;與未處理組相比,腹部照射后小鼠體重逐步減輕、小腸絨毛變短、隱窩數(shù)目減少、腸隱窩干細(xì)胞數(shù)量在短時間內(nèi)迅速減少。
　　結(jié)論：本部分研究采用18 G

6、y劑量單純輻照小鼠腹部,建立了腸上皮輻射損傷小鼠模型。在此基礎(chǔ)上觀察了腸上皮輻射損傷病理規(guī)律。這為急性輻射損傷救治的研究提供了良好的研究工具。
　　第二部分：Rspo1基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞株的構(gòu)建及生物學(xué)活性鑒定。
　　目的：構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Rspo1的基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞株。
　　方法：將人Rspo1全長cDNA重組入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pEGZ-Term,通過與輔助病毒載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝為具有感染力的完整重組病毒載

7、體,收集培養(yǎng)上清感染間充質(zhì)干細(xì)胞C3H10 T1/2細(xì)胞株,篩選獲得G418抗性的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞,通過RT-PCR與流式細(xì)胞術(shù)檢測感染后C3H10 T1/2細(xì)胞Rspo1分子的表達(dá),并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察其上清對結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480增殖能力的促進(jìn)作用。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建 pEGZ-Term/Rspo1逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體,獲得了穩(wěn)定表達(dá)人Rspo1的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株C3H10/Rspo1,該細(xì)胞株上清能促進(jìn)SW480結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。<

8、br>　　結(jié)論：建立了穩(wěn)定表達(dá)Rspo1的基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞株,并證實(shí)其分泌的Rspo1具有生物學(xué)活性,為進(jìn)一步利用Rspo1和間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合靶向作用于腸道干細(xì)胞救治腸上皮損傷的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分：Rspo1基因轉(zhuǎn)染間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)小鼠腸上皮輻射損傷。
　　目的：利用間充質(zhì)干細(xì)胞的保護(hù)作用聯(lián)合 Rspo1靶向修復(fù)腸上皮輻射損傷小鼠。
　　方法：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測C3H10 T1/2細(xì)胞株表面趨化因子受體

9、和相關(guān)負(fù)性免疫分子的表達(dá);通過胞內(nèi)染色的方法,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測C3H10 T1/2細(xì)胞株內(nèi)相關(guān)免疫抑制與激活細(xì)胞因子的表達(dá);利用 ELISA法檢測 C3H10 T1/2細(xì)胞上清中PEG2的含量;采用18 Gy輻照劑量單純照射小鼠腹部,將PBS、C3H10 T1/2細(xì)胞株、第二部分構(gòu)建的C3H10/mock細(xì)胞株及C3H10/Rspo1細(xì)胞株分別移植入腸上皮輻照損傷小鼠,每日觀察小鼠的生存狀況及體重變化。
　　結(jié)果：C3H10 T

10、1/2細(xì)胞株可表達(dá)趨化因子受體CXCR4和PD-L1、B7H3、B7H4等多種負(fù)性免疫分子,產(chǎn)生 TGF-β、IL-10、IL-4和分泌 PGE2等免疫抑制因子;對于腸上皮輻照損傷小鼠,C3H10/Rspo1移植組小鼠的存活率大于單純C3H10 T1/2移植組小鼠的存活率,而PBS移植組小鼠在兩周內(nèi)全部死亡,同時C3H10/Rspo1移植組小鼠體重降低明顯低于單純C3H10 T1/2移植組。
　　結(jié)論：C3H10/Rspo1細(xì)胞株