耐輻射奇球菌RecO、RecF原核與真核表達體系的構建及抗紫外輻射損傷效應的研究.pdf

1、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)是迄今為止發(fā)現的對電離輻射、紫外線、干燥、化學誘變劑和其它一些DNA損傷因子耐受性最強的一類細菌。這種極端抗性被認為是由于D．radiodurans具有一套高效DNA損傷修復系統(tǒng)。在DNA損傷方面，5000 Gyγ射線可以在D.radiodurans每個基因組中產生大約200多個斷裂的DNA雙鏈片段(DNA double-strand breaks，DSBs)，大于3

2、000個斷裂的DNA單鏈片段(DNAsingle-strand breaks，SSBs)和超過1000個堿基損傷位點。在這些DNA損傷當中，DNA雙鏈斷裂對于細胞的生存是最致命的。D.radiodurans可在數小時內把這些DNA損傷全部修復，精確重建基因組并保持活力和性狀的穩(wěn)定。 近年來的研究結果顯示，D.radiodurans的輻射抗性源于其高效的DNA修復能力，同時電離輻射和紫外輻射產生大量的氧自由基，可間接造成DNA損傷

3、。因此，D．radiodurans超強的輻射抗性可能與其抗氧化能力密切相關。D．radiodurans在長期的進化過程中形成的氧化防御體系，包括酶類和非酶類。它們能清除氧自由基，參與抗氧化系統(tǒng)的調控，有效防止自由基所致的DNA損傷，表現出超強抗氧化和耐輻射能力。對D．radiodurans極端抗性和DNA損傷修復機制的研究，將有利于更好的研究腫瘤細胞的發(fā)病機制和尋找抗輻射藥物，并可將其用于輻射污染環(huán)境的修復。 ReeFOR途徑

4、是D．radiodurans同源重組特有的修復途徑。本研究擬選擇參與D．radiodurans重組修復ReeFOR途徑的兩個關鍵基因recO和recF，分別構建D．radiodurans RecO租ReeF原核和真核表達體系，觀察目的基因在宿主受到紫外輻射時的防護效應，為后續(xù)紫外生物防護的研究提供實驗依據。 一、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)RecO和ReeF原核表達體系的建立 1

5、．根據GenBank收錄的D．radiodurans(Dr)基因序列recO(DR0819)和recF(DR1089)編碼區(qū)，應用Primer5．0分別設計特異性引物，以D．radiodurans基因組為模板，PCR擴增recO和recF全長基因。將得到的PCR片段T-A克隆于pGEM-T載體，測序驗證。 2．將測序驗證的recO和recF連接于表達載體pET30b(+)，轉化構建的原核表達重組質粒pET30b(+)-recO和

6、pET30b(+)-recF至E.coli BL21(DE3)。 3．優(yōu)化RecF、RecO蛋白誘導條件：選擇不同的IPTG濃度、不同的誘導時間及溫度對蛋白表達量的影響，確定蛋白誘導的最佳條件。研究表明，IPTG濃度為0．3 mM，16℃誘導過夜，RecF融合蛋白表達量最高；IPTG濃度為0．1 mM，37℃誘導2～3 h，ReeO融合蛋白表達量最高。 4．接受UVC輻照后E.coli pET30b(+)-recO、E.

7、coli pET30b(+)-recF、E.coli BL21(DE3)和E.coli pET30b(+)的生存率都受到抑制，從接受50 J/cm2 UVC輻照開始E.colipET30b(+)-recF的生存率明顯高于其它三株菌；E.coli pET30b(+)-recO能耐受UVC的輻照劑量顯著低于E.coli pET30b(+)-recF，但明顯高于另外兩株菌。RecF的保護作用強于RecO。 二、轉染recO或recF基

8、因的人皮膚成纖維細胞抗UVB損傷效應的研究 1．建立轉染人皮膚成纖維細胞模型：采用胰酶消化法體外分離和培養(yǎng)人皮膚成纖維細胞(HSF)。在細胞分離后第3天，消化細胞傳代，HE染色觀察成纖維細胞的純度。染色后鏡下可見細胞邊緣清晰，包體呈梭狀或多角形，核仁清晰，胞核凸起明顯。通過測定生長曲線，確定分離后4～7天為其對數生長期，此階段細胞生長活躍，繁殖旺盛，適合后續(xù)輻照實驗對細胞數量的要求。 用脂質體法將構建的pcDNA3．1-

9、NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3．1-NT-GFPFusion TOPO-recF重組質粒轉染至體外培養(yǎng)HSF，通過MTT檢測未轉染HSF增殖活性變化確定0、30、90、120 mJ/cm2 UVB為實驗劑量。 2．MTT法測定細胞生長曲線：共設4個實驗組(轉染recO未輻照組、轉染recO輻照組、轉染recF未輻照組、轉染recF輻照組)和3個對照組(未轉染未輻照組、未轉染輻照組、轉染空質粒輻照組)

10、開展MTT實驗，結果顯示：未轉染未輻照組、轉染recO未輻照組、轉染recF未輻照組生長曲線無顯著性差異。轉染recO輻照組和轉染recF輻照組細胞增殖活性在接受90 mJ/cm2 UVB輻照后第4天開始恢復，與未轉染未輻照組和轉染空質粒輻照組有顯著性差異(P<0．05)。盡管接受90 mJ/cm2 UVB輻照后轉染recO輻照組和轉染recF輻照組細胞增殖活性能在一定程度上恢復，相較于未受輻照的細胞來說被輻照細胞的增殖活性受到強烈抑制

11、。 3．RecF和RecO轉染組輻照損傷形態(tài)學比較：未轉染HSF接受不同劑量UVB輻照后24 h，細胞表現出不同程度的損傷，以120 mJ/cm2 UVB損傷作用最為強烈。HSF經UVB照射30 mJ/cm2后，細胞逐漸變圓，腫脹，細胞出現空泡；照射劑量增加至90 mJ/cm2后細胞碎片和死亡細胞急劇增加。此外，在同一中等UVB輻照劑量下(≥90 mJ/cm2)，隨培養(yǎng)時間的延長，細胞受損程度加重，具有明顯時效關系。未轉染未輻照

12、組及轉染recO未輻照組和轉染recF未輻照組細胞形態(tài)無異。90 mJ/cm2 UVB輻照后轉染recO輻照組和轉染recF輻照組細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，以最初的梭形或多角形變?yōu)椴灰?guī)則形狀，胞漿中空泡化明顯，胞間的縫隙增大，但未見明顯的細胞碎片和死亡細胞。該結果提示轉染recO或轉染recF能在一定程度上減緩由UVB輻照引發(fā)的HSF凋亡。 5．細胞抗損傷能力檢測：培養(yǎng)液中LDH可作為反映細胞早期損傷比較敏感的指標之一，存在于細胞漿

13、中。當離體培養(yǎng)的細胞受到某些因素刺激時，細胞膜通透性發(fā)生改變LDH可以從細胞中漏出。用選定UVB劑量輻照HSF后在24 h、48 h、72 h三個時相點檢測培養(yǎng)液中LDH濃度。UVB在低劑量時，對未轉染組細胞即有損傷作用，引起LDH向細胞外滲透，高劑量時更為明顯。轉染recO和recF組LDH含量與未轉染組和轉染空質粒組相比在UVB照射后24 h無明顯差異(P>0．05)，在照射后48～72 h轉染空質粒組與轉染recF組(P<0．01

14、)和轉染recO組(P<0．05)LDH有顯著性差異。 6．細胞抗氧化能力檢測：SOD活力高低可間接反映細胞清除氧自由基的能力，MDA是脂質過氧化物的產物，其含量的高低間接反映了細胞脂質過氧化程度和細胞受自由基攻擊后的損傷程度。體外分離培養(yǎng)HSF在接受30 mJ/cm2 UVB輻照后，細胞存活率和T-SOD的活力呈劑量依賴性的下降，而LDH和MDA的含量呈劑量依賴性升高。輻照后24～72 h，轉染recO和recF都能在一定程度

15、上緩解了UVB引起的細胞T-SOD下降，MDA升高，增殖活力下降，提高了HSF細胞清除氧自由基的能力。 7．細胞抗炎能力檢測：在活體皮膚組織中，防御外界刺激主要依靠的人皮膚角化細胞(HKC)能接受外界刺激后開始激活細胞內的信號傳遞系統(tǒng)。HKC在受到紫外線刺激后開始分泌IL-1α，間接誘導包括HSF在內的多種細胞生成IL-6。TNF-α是誘發(fā)腫瘤和調控機體免疫反應的關鍵因子，與UVB輻射引起的皮膚損傷、炎癥反應和細胞凋亡等密切相關

16、。本實驗中UVB對未轉染組、轉染空質粒組及轉染recO和recF組細胞中IL-6和TNF-α分泌的結果表明UVB輻照能促進離體細胞IL-6及TNF-α的分泌增加，分泌量在一定范圍內隨照射劑量升高而呈上升趨勢。轉染recO和recF后HSF細胞IL-6分泌明顯低于接受同等輻射劑量的未轉染組和轉染空質粒組。 綜上所述，本研究將D.radiadurans的recF和recO克隆于pET30b(+)表達載體，使其表達處于T7噬菌體強啟動

17、子轉錄和翻譯的信號控制之下，IPTG誘導在宿主菌Ecoli BL21(DE3)中高效表達，初步建立了recO和recF表達體系。體外實驗初步驗證了RecO和RecF能提高E.coli對紫外線的抵抗能力。用脂質體法將構建的pcDNA3．1-NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3．1-NT-GFP Fusion TOPO-recF重組質粒轉染至體外培養(yǎng)的HSF，分別觀察轉染HSF抗UVB損傷的效應。結果提示：轉染HSF

18、中的recF和recO均能增強細胞對氧自由基的清除能力，抑制細胞脂質過氧化來緩解UVB對細胞造成的損傷，增加細胞對UVB損傷的抵抗能力。其中轉染reeF組細胞的生存率、抗氧化及抗損傷效應明顯強于轉染recO組細胞，其具體機制還有待進一步深入研究。 目前國內外對D．radiodurans抗輻射效應的研究主要集中在電離輻射損傷。本研究通過構建D.radiodurans高效蛋白表達體系；轉染recF與recO至人皮膚成纖維細胞，發(fā)現轉