耐輻射奇球菌RecO、RecF原核與真核表達(dá)體系的構(gòu)建及抗紫外輻射損傷效應(yīng)的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的對(duì)電離輻射、紫外線(xiàn)、干燥、化學(xué)誘變劑和其它一些DNA損傷因子耐受性最強(qiáng)的一類(lèi)細(xì)菌。這種極端抗性被認(rèn)為是由于D.radiodurans具有一套高效DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)。在DNA損傷方面,5000 Gyγ射線(xiàn)可以在D.radiodurans每個(gè)基因組中產(chǎn)生大約200多個(gè)斷裂的DNA雙鏈片段(DNA double-strand breaks,DSBs),大于3

2、000個(gè)斷裂的DNA單鏈片段(DNAsingle-strand breaks,SSBs)和超過(guò)1000個(gè)堿基損傷位點(diǎn)。在這些DNA損傷當(dāng)中,DNA雙鏈斷裂對(duì)于細(xì)胞的生存是最致命的。D.radiodurans可在數(shù)小時(shí)內(nèi)把這些DNA損傷全部修復(fù),精確重建基因組并保持活力和性狀的穩(wěn)定。 近年來(lái)的研究結(jié)果顯示,D.radiodurans的輻射抗性源于其高效的DNA修復(fù)能力,同時(shí)電離輻射和紫外輻射產(chǎn)生大量的氧自由基,可間接造成DNA損傷

3、。因此,D.radiodurans超強(qiáng)的輻射抗性可能與其抗氧化能力密切相關(guān)。D.radiodurans在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成的氧化防御體系,包括酶類(lèi)和非酶類(lèi)。它們能清除氧自由基,參與抗氧化系統(tǒng)的調(diào)控,有效防止自由基所致的DNA損傷,表現(xiàn)出超強(qiáng)抗氧化和耐輻射能力。對(duì)D.radiodurans極端抗性和DNA損傷修復(fù)機(jī)制的研究,將有利于更好的研究腫瘤細(xì)胞的發(fā)病機(jī)制和尋找抗輻射藥物,并可將其用于輻射污染環(huán)境的修復(fù)。 ReeFOR途徑

4、是D.radiodurans同源重組特有的修復(fù)途徑。本研究擬選擇參與D.radiodurans重組修復(fù)ReeFOR途徑的兩個(gè)關(guān)鍵基因recO和recF,分別構(gòu)建D.radiodurans RecO租ReeF原核和真核表達(dá)體系,觀察目的基因在宿主受到紫外輻射時(shí)的防護(hù)效應(yīng),為后續(xù)紫外生物防護(hù)的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 一、耐輻射奇球菌(Deinococcus radiodurans, Dr)RecO和ReeF原核表達(dá)體系的建立 1

5、.根據(jù)GenBank收錄的D.radiodurans(Dr)基因序列recO(DR0819)和recF(DR1089)編碼區(qū),應(yīng)用Primer5.0分別設(shè)計(jì)特異性引物,以D.radiodurans基因組為模板,PCR擴(kuò)增recO和recF全長(zhǎng)基因。將得到的PCR片段T-A克隆于pGEM-T載體,測(cè)序驗(yàn)證。 2.將測(cè)序驗(yàn)證的recO和recF連接于表達(dá)載體pET30b(+),轉(zhuǎn)化構(gòu)建的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30b(+)-recO和

6、pET30b(+)-recF至E.coli BL21(DE3)。 3.優(yōu)化RecF、RecO蛋白誘導(dǎo)條件:選擇不同的IPTG濃度、不同的誘導(dǎo)時(shí)間及溫度對(duì)蛋白表達(dá)量的影響,確定蛋白誘導(dǎo)的最佳條件。研究表明,IPTG濃度為0.3 mM,16℃誘導(dǎo)過(guò)夜,RecF融合蛋白表達(dá)量最高;IPTG濃度為0.1 mM,37℃誘導(dǎo)2~3 h,ReeO融合蛋白表達(dá)量最高。 4.接受UVC輻照后E.coli pET30b(+)-recO、E.

7、coli pET30b(+)-recF、E.coli BL21(DE3)和E.coli pET30b(+)的生存率都受到抑制,從接受50 J/cm2 UVC輻照開(kāi)始E.colipET30b(+)-recF的生存率明顯高于其它三株菌;E.coli pET30b(+)-recO能耐受UVC的輻照劑量顯著低于E.coli pET30b(+)-recF,但明顯高于另外兩株菌。RecF的保護(hù)作用強(qiáng)于RecO。 二、轉(zhuǎn)染recO或recF基

8、因的人皮膚成纖維細(xì)胞抗UVB損傷效應(yīng)的研究 1.建立轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細(xì)胞模型:采用胰酶消化法體外分離和培養(yǎng)人皮膚成纖維細(xì)胞(HSF)。在細(xì)胞分離后第3天,消化細(xì)胞傳代,HE染色觀察成纖維細(xì)胞的純度。染色后鏡下可見(jiàn)細(xì)胞邊緣清晰,包體呈梭狀或多角形,核仁清晰,胞核凸起明顯。通過(guò)測(cè)定生長(zhǎng)曲線(xiàn),確定分離后4~7天為其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此階段細(xì)胞生長(zhǎng)活躍,繁殖旺盛,適合后續(xù)輻照實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞數(shù)量的要求。 用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的pcDNA3.1-

9、NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3.1-NT-GFPFusion TOPO-recF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)HSF,通過(guò)MTT檢測(cè)未轉(zhuǎn)染HSF增殖活性變化確定0、30、90、120 mJ/cm2 UVB為實(shí)驗(yàn)劑量。 2.MTT法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn):共設(shè)4個(gè)實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染recO未輻照組、轉(zhuǎn)染recO輻照組、轉(zhuǎn)染recF未輻照組、轉(zhuǎn)染recF輻照組)和3個(gè)對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染未輻照組、未轉(zhuǎn)染輻照組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒輻照組)

10、開(kāi)展MTT實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示:未轉(zhuǎn)染未輻照組、轉(zhuǎn)染recO未輻照組、轉(zhuǎn)染recF未輻照組生長(zhǎng)曲線(xiàn)無(wú)顯著性差異。轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細(xì)胞增殖活性在接受90 mJ/cm2 UVB輻照后第4天開(kāi)始恢復(fù),與未轉(zhuǎn)染未輻照組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒輻照組有顯著性差異(P<0.05)。盡管接受90 mJ/cm2 UVB輻照后轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細(xì)胞增殖活性能在一定程度上恢復(fù),相較于未受輻照的細(xì)胞來(lái)說(shuō)被輻照細(xì)胞的增殖活性受到強(qiáng)烈抑制

11、。 3.RecF和RecO轉(zhuǎn)染組輻照損傷形態(tài)學(xué)比較:未轉(zhuǎn)染HSF接受不同劑量UVB輻照后24 h,細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的損傷,以120 mJ/cm2 UVB損傷作用最為強(qiáng)烈。HSF經(jīng)UVB照射30 mJ/cm2后,細(xì)胞逐漸變圓,腫脹,細(xì)胞出現(xiàn)空泡;照射劑量增加至90 mJ/cm2后細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞急劇增加。此外,在同一中等UVB輻照劑量下(≥90 mJ/cm2),隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞受損程度加重,具有明顯時(shí)效關(guān)系。未轉(zhuǎn)染未輻照

12、組及轉(zhuǎn)染recO未輻照組和轉(zhuǎn)染recF未輻照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)異。90 mJ/cm2 UVB輻照后轉(zhuǎn)染recO輻照組和轉(zhuǎn)染recF輻照組細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始發(fā)生變化,以最初的梭形或多角形變?yōu)椴灰?guī)則形狀,胞漿中空泡化明顯,胞間的縫隙增大,但未見(jiàn)明顯的細(xì)胞碎片和死亡細(xì)胞。該結(jié)果提示轉(zhuǎn)染recO或轉(zhuǎn)染recF能在一定程度上減緩由UVB輻照引發(fā)的HSF凋亡。 5.細(xì)胞抗損傷能力檢測(cè):培養(yǎng)液中LDH可作為反映細(xì)胞早期損傷比較敏感的指標(biāo)之一,存在于細(xì)胞漿

13、中。當(dāng)離體培養(yǎng)的細(xì)胞受到某些因素刺激時(shí),細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變LDH可以從細(xì)胞中漏出。用選定UVB劑量輻照HSF后在24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)相點(diǎn)檢測(cè)培養(yǎng)液中LDH濃度。UVB在低劑量時(shí),對(duì)未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞即有損傷作用,引起LDH向細(xì)胞外滲透,高劑量時(shí)更為明顯。轉(zhuǎn)染recO和recF組LDH含量與未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組相比在UVB照射后24 h無(wú)明顯差異(P>0.05),在照射后48~72 h轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染recF組(P<0.01

14、)和轉(zhuǎn)染recO組(P<0.05)LDH有顯著性差異。 6.細(xì)胞抗氧化能力檢測(cè):SOD活力高低可間接反映細(xì)胞清除氧自由基的能力,MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)物,其含量的高低間接反映了細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞受自由基攻擊后的損傷程度。體外分離培養(yǎng)HSF在接受30 mJ/cm2 UVB輻照后,細(xì)胞存活率和T-SOD的活力呈劑量依賴(lài)性的下降,而LDH和MDA的含量呈劑量依賴(lài)性升高。輻照后24~72 h,轉(zhuǎn)染recO和recF都能在一定程度

15、上緩解了UVB引起的細(xì)胞T-SOD下降,MDA升高,增殖活力下降,提高了HSF細(xì)胞清除氧自由基的能力。 7.細(xì)胞抗炎能力檢測(cè):在活體皮膚組織中,防御外界刺激主要依靠的人皮膚角化細(xì)胞(HKC)能接受外界刺激后開(kāi)始激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞系統(tǒng)。HKC在受到紫外線(xiàn)刺激后開(kāi)始分泌IL-1α,間接誘導(dǎo)包括HSF在內(nèi)的多種細(xì)胞生成IL-6。TNF-α是誘發(fā)腫瘤和調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)的關(guān)鍵因子,與UVB輻射引起的皮膚損傷、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)

16、。本實(shí)驗(yàn)中UVB對(duì)未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組及轉(zhuǎn)染recO和recF組細(xì)胞中IL-6和TNF-α分泌的結(jié)果表明UVB輻照能促進(jìn)離體細(xì)胞IL-6及TNF-α的分泌增加,分泌量在一定范圍內(nèi)隨照射劑量升高而呈上升趨勢(shì)。轉(zhuǎn)染recO和recF后HSF細(xì)胞IL-6分泌明顯低于接受同等輻射劑量的未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組。 綜上所述,本研究將D.radiadurans的recF和recO克隆于pET30b(+)表達(dá)載體,使其表達(dá)處于T7噬菌體強(qiáng)啟動(dòng)

17、子轉(zhuǎn)錄和翻譯的信號(hào)控制之下,IPTG誘導(dǎo)在宿主菌Ecoli BL21(DE3)中高效表達(dá),初步建立了recO和recF表達(dá)體系。體外實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證了RecO和RecF能提高E.coli對(duì)紫外線(xiàn)的抵抗能力。用脂質(zhì)體法將構(gòu)建的pcDNA3.1-NT-GFP Fusion TOPO-recO和pcDNA3.1-NT-GFP Fusion TOPO-recF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HSF,分別觀察轉(zhuǎn)染HSF抗UVB損傷的效應(yīng)。結(jié)果提示:轉(zhuǎn)染HSF

18、中的recF和recO均能增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)氧自由基的清除能力,抑制細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化來(lái)緩解UVB對(duì)細(xì)胞造成的損傷,增加細(xì)胞對(duì)UVB損傷的抵抗能力。其中轉(zhuǎn)染reeF組細(xì)胞的生存率、抗氧化及抗損傷效應(yīng)明顯強(qiáng)于轉(zhuǎn)染recO組細(xì)胞,其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)D.radiodurans抗輻射效應(yīng)的研究主要集中在電離輻射損傷。本研究通過(guò)構(gòu)建D.radiodurans高效蛋白表達(dá)體系;轉(zhuǎn)染recF與recO至人皮膚成纖維細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)

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