Bcr-abl特異性樹突狀細(xì)胞瘤苗的構(gòu)建.pdf

1、中山大學(xué)碩士學(xué)位論文Bcrabl特異性樹突狀細(xì)胞瘤苗的構(gòu)建姓名：胡元申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：內(nèi)科學(xué)指導(dǎo)教師：黃仁魏20060601中山大學(xué)碩士學(xué)位論文Dc的轉(zhuǎn)染率可高達(dá)40％～60％，并穩(wěn)定、持續(xù)表達(dá)目的基因，誘導(dǎo)出特異性CTL活性。目前常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體多由Moloney小鼠白血病病毒(Moloneymurineleukemiavirus：MoMLV)改建而來，保留了順式功能結(jié)構(gòu)，剔除了DNA基因結(jié)構(gòu)中的gag、pol、env=部分

2、致病性反式功能序列，并以外源基因替代空白區(qū)，故為缺陷病毒，所缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)基因區(qū)由缺失包裝信號(hào)(Ⅲ)的包裝細(xì)胞反式供給，這樣可防止與逆轉(zhuǎn)錄病毒之間的重組而產(chǎn)生完整的病毒基因組造成機(jī)體損害。本課題的前期研究已總結(jié)出體外從外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuelearcell：PBMC)誘導(dǎo)分化Dc的成熟技術(shù)。本研究通過克隆ber／abl基因，連接表達(dá)缺陷的逆轉(zhuǎn)錄病毒，構(gòu)建bcr／abl重組表達(dá)載體，逆轉(zhuǎn)錄病

3、毒介導(dǎo)bcr／abl融合基因轉(zhuǎn)染臍血干細(xì)胞來源DC，構(gòu)建Bcr／abl特異性DC瘤苗，為進(jìn)一步的DC瘤苗抗CML研究打下基礎(chǔ)。材料與方法一bcr／abl融合基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建1引物設(shè)計(jì)根據(jù)pGD210全長(zhǎng)ber／abl融合基因序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物用于擴(kuò)增誘導(dǎo)特異CTL所需bcr／abl融合位點(diǎn)兩側(cè)的基因序列。2bcr／abl基因片段的合成1)K562細(xì)胞株的培養(yǎng)：用含10％小牛血清的RPMI一1640培養(yǎng)液于37℃、5％C02培養(yǎng)箱內(nèi)

4、常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液。2)從K562細(xì)胞提取總RNA：收集5106個(gè)K562細(xì)胞，Trizol法從K562細(xì)胞提取總RNA，電泳檢測(cè)并核酸蛋白分析儀NoD值定量RNA濃度。3)RT—PCR擴(kuò)增bcr／abl片段：逆轉(zhuǎn)錄合成eDNA，以eDNA為模板，用bcr／abl特異引物進(jìn)行PeR擴(kuò)增得到含BarnHI、＆。RI雙酶切位點(diǎn)的490bp大小的bcr／abl片段，電泳檢測(cè)并核酸蛋白分析儀NoD值、濃度。3提取載體pLXSN質(zhì)粒于瓊脂平板上挑