特異性表達Her-2抗原樹突狀細胞治療肺癌的體外研究.pdf

1、目的：
　　構(gòu)建特異性表達Her-2的慢病毒載體，探索慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染DCs后誘導淋巴細胞活化增殖能力和其抗腫瘤免疫應答效應，并對比其與單純DCs誘導CIK殺傷Her-2陽性肺癌的能力差異。
　　方法：
　　1．構(gòu)建表達Her-2基因的慢病毒載體：以pcDNA3.1-ERBB2-EGFP為模板，設計含Not I和Xba I酶切點引物，PCR法擴增ERBB2基因片段，T4連接酶連接慢病毒制備表達Her-2基因的慢病毒質(zhì)粒，

2、感受態(tài)細胞單克隆復制挑選表達Her-2基因的慢病毒，PCR法鑒定克隆產(chǎn)物的正確性，293T細胞進行慢病毒包裝，36h后收集上清液即可獲得表達Her-2的慢病毒載體顆粒，密度梯度稀釋法檢測病毒滴度。
　　2．制備表達Her-2蛋白的DC疫苗：收集人外周血液單個核細胞，通過IL-4， GM-CSF等細胞因子定向誘導，制備DCs。在DCs培養(yǎng)第5天分別加入攜帶Her-2基因慢病毒載體和空載體進行轉(zhuǎn)染（MOI=10），第6天加入腫瘤壞死因

3、子α刺激成熟，第8天收集DCs。顯微鏡下查看病毒感染DCs后綠色熒光呈現(xiàn)情況，流式細胞儀檢測慢病毒載體轉(zhuǎn)染后成熟DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表達情況，并與傳統(tǒng)單純DCs和空載體DCs進行比較。
　　3．檢測淋巴細胞增殖情況：利用CD3、IL-2等因子體外誘導培養(yǎng)外周血單個核細胞，制備CIK疫苗。當培養(yǎng)至第8日時，分別與LV-Her2-DCs、LV-DCs和單純DCs共培養(yǎng)，以刺激CIK增殖活化。流式細胞儀檢測CIK

4、表面CD3/56表達情況，酶標儀檢測450nm下OD值，判斷三組CIK增殖情況。
　　4．體外殺傷腫瘤細胞：免疫組化挑選一株表達Her-2的肺癌細胞，將三組DC-CIK和Her-2陽性肺癌細胞分別以10:1、20:1、40:1的效靶比共培養(yǎng)殺傷48小時，CCK8法檢測三組DC-CIK疫苗的殺傷能力。
　　結(jié)果：
　　1．成功構(gòu)建編碼Her-2基因的慢病毒載體，顯微鏡下可見293T細胞呈現(xiàn)綠色熒光，提示目的基因轉(zhuǎn)入靶細胞

5、。病毒滴度為：2 x108TU/ml。
　　2．成功培養(yǎng)特異性表達Her-2的DC疫苗，當MOI=10時，空載體病毒和含Her-2基因的慢病毒轉(zhuǎn)染DC后細胞表面綠色熒光蛋白表達率分別為40.2％和41.8%，兩組DC感染率無明顯差異（p=0.293），提示攜帶Her-2基因并不影響慢病毒轉(zhuǎn)染能力。DCs表面CD1α/83/86和HLA-DR表達量提示DC成熟，轉(zhuǎn)染病毒后不影響DC分化成熟能力。
　　3．成功從外周血中獲取單個

6、核細胞進行CIK培養(yǎng)，顯微鏡下觀察細胞呈懸浮生長，易集群，流式細胞儀檢測提示三組CIK表面CD3/56因子均有表達， LV-Her2-DC誘導CIK活化增殖能力約為LV-DC或單純DC的2倍（p=0.00）。其中，LV-DC和單純DC誘導CIK增殖能力無明顯差異（p=0.06），LV-Her2-DC誘導CIK增殖能力與單純DC對照組相比較具有明顯的統(tǒng)計學差異（p=0.007）。
　　4．免疫組化結(jié)果證實A549肺癌細胞株呈弱且不完

7、整的胞膜著色；應用CCK8試劑盒檢測LV-Her2-DC-CIK實驗組在以10:1、20:1、40:1的效靶比對A549肺癌細胞株的殺傷能力，殺傷率依次為：26.9%、43.8%、52%。明顯高于單純DC-CIK對照組的殺瘤率（P＜0.05），而LV-DC-CIK空載體組與單純DC-CIK對照組的殺瘤率相比無統(tǒng)計學差異（p＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．本研究構(gòu)建重組Her-2基因片段的慢病毒載體能夠有效轉(zhuǎn)染DCs。