Bcr-abl基因修飾樹突狀細(xì)胞疫苗的制備及其誘導(dǎo)CTLs殺傷K562細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的： 1、克隆含慢性粒細(xì)胞白血病P210<'bcr/abl>融合蛋白抗原表位的bcr/albl基因片段，連接復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體，構(gòu)建pAd-bcr/abl重組體，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后包裝產(chǎn)生復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-bcr/abl。 2、體外聯(lián)合細(xì)胞因子rhGM-CSF和rhIL-4由健康人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)出DC，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫表型等方面對(duì)DC進(jìn)行鑒定。 3、轉(zhuǎn)導(dǎo)了腫瘤抗原基因的復(fù)制缺陷

2、型重組腺病毒Ad-bcr/abl感染DC，制備bcr/abl特異性的樹突狀細(xì)胞瘤苗。 4、研究DC分別經(jīng)重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染及bcr/abl多肽負(fù)載后，與經(jīng)IL-2誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，體外誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的CTLs，觀察CTLs對(duì)白血病K562細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，比較病毒載體轉(zhuǎn)染與多肽負(fù)載DC誘導(dǎo)殺傷白血病細(xì)胞的差異。 結(jié)果 1、構(gòu)建pAd-bcr/abl重組腺病毒載體 1．1 構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pAdT

3、rack-CMV-bcr/abl 1．1．1 K562細(xì)胞總RNA的提取及RT-PCR擴(kuò)增目的基因Trizol法提取K562細(xì)胞總RNA，測(cè)得RNA濃度為998．2ng/ul，OD<,260/280>為1．76。凝膠電泳可見明亮的18S、28S條帶。RT-PCR擴(kuò)增bcr/abl融合位點(diǎn)兩側(cè)堿基序列，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)得終濃度72ng/ul，1﹪瓊脂糖凝膠電泳接近500bp處可見明亮條帶。 1．1．2 腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdT

4、rack-CMV的小量提取小量提取腺病毒穿梭質(zhì)粒padTrack-CMV，測(cè)得終濃度為34ng/ul，O<,260-280>為1．84。 1．1．3 pAdTrack-CMV-bcr/abl重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定雙酶切目的基因和穿梭載體，純化后以T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物經(jīng)卡那霉素篩選，過(guò)夜培養(yǎng)后見數(shù)百個(gè)克隆生長(zhǎng)。挑取7個(gè)培養(yǎng)克隆提取質(zhì)粒，雙酶切后產(chǎn)物進(jìn)行電泳，其中5個(gè)克隆均可見接近500bp處及9．2kb兩

5、條帶。以雙酶切得到大小相符兩條片段的重組體質(zhì)粒為模板，bcr/abl特異性引物PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳亦可見接近500bp處條帶。將雙酶切及PCR鑒定正確的重組穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-bcr/abl進(jìn)行DNA序列測(cè)定，結(jié)果與NCBI Gene Bank所公布bcr/abl融合基因序列(序列號(hào)A131466)完全匹配，未發(fā)生堿基缺失或突變。 1．2 重組腺病毒質(zhì)粒pad-bcr/abl的構(gòu)建及鑒定 重組穿梭質(zhì)粒

6、線性化后與病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化大腸桿菌BJ5183進(jìn)行同源重組，經(jīng)卡那霉素篩選，過(guò)夜培養(yǎng)見數(shù)十余個(gè)克隆生長(zhǎng)。挑取13個(gè)培養(yǎng)克隆提取質(zhì)粒，0.8﹪瓊脂糖凝膠電泳后選取大小大于病毒骨架質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化克隆并進(jìn)一步用Pac Ⅰ酶切，產(chǎn)物電泳見到一條3.0kb的小片段及一條約30kb大片段的即為重組腺病毒質(zhì)粒pAd-bcr/abl。 1．3 去內(nèi)毒素中量提取重組腺病毒質(zhì)粒pAd-bcr/ablpAd-bcr/abl重組腺病毒質(zhì)粒去內(nèi)毒素中量提

7、取，測(cè)得濃度為600ng/ul。 2、重組腺病毒Ad-bcr/abl的包裝重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞后，可見轉(zhuǎn)染后24h即有GFP表達(dá)，量較少，以后逐漸增多，約在第5d時(shí)熒光表達(dá)量最多。液氮/37℃反復(fù)凍融獲得的病毒液重復(fù)感染293A細(xì)胞后，隨放大次數(shù)的增加，病毒滴度逐漸增高，顯微鏡下見感染后細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，胞體變圓并逐漸從壁上脫落。倒置熒光顯微鏡下可見到綠色熒光蛋白(GFP)大量表達(dá)。 3

8、、重組腺病毒Ad-bcr/abl中目的基因的檢測(cè)及病毒滴度測(cè)定 3．1 PCR檢測(cè)重組腺病毒Ad-bcr/abl中目的基因第7代病毒裂解液和正常培養(yǎng)293A細(xì)胞上清為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行1﹪瓊脂糖凝膠電泳，可見病毒液樣本中均在接近500bp處有明亮條帶，而對(duì)照樣本未見相應(yīng)條帶。 3．2 病毒滴度測(cè)定取10<'-5>稀釋度的293A細(xì)胞進(jìn)行滴度測(cè)定，細(xì)胞計(jì)數(shù)為8.8×10<'5>，GFP表達(dá)率16﹪。病毒滴度(

9、pfu/ml)=(細(xì)胞總數(shù)×GFP表達(dá)率×病毒稀釋度)/0.7=2.0×10<'10> 4、外周血來(lái)源樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定。 4.1 形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，培養(yǎng)24h后可見貼壁細(xì)胞呈集落性生長(zhǎng)，第3-5d見部分細(xì)胞懸浮，體積增大，圓形或不規(guī)則形，表面有毛刺樣或偽足樣凸起。第7d，大部分細(xì)胞呈懸浮生長(zhǎng)，體積明顯增大，表面?zhèn)巫銟蛹皹渲油蛊疠^前增多且更加明顯。 4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)記

10、培養(yǎng)第3d DC表面標(biāo)記CD14為77.1﹪、CD40為98﹪、CD80為22﹪、CD83為14.2﹪、CD86為98.5﹪；培養(yǎng)第8d的DC表面標(biāo)記CD14為5.58﹪、CD40為68.6﹪、CD80為26.5﹪、CD83為23﹪、CD86為98.6﹪。單核細(xì)胞特征性標(biāo)志CD14接近陰性，而成熟DC的標(biāo)志CD83上升至23﹪，且高表達(dá)CD40、CD86等共刺激分子，表明經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，大部分單核細(xì)胞轉(zhuǎn)變成了樹突狀細(xì)胞。 5

11、、重組腺病毒轉(zhuǎn)染DC構(gòu)建bcr/abl特異性樹突狀細(xì)胞瘤苗重組腺病毒轉(zhuǎn)染培養(yǎng)第6d的DC，轉(zhuǎn)染后24h熒光倒置顯微鏡下可見到被轉(zhuǎn)染的DC內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，且48h后熒光較前增多，轉(zhuǎn)染效率約為50～60﹪。收集重組腺病毒轉(zhuǎn)染的DC，即為構(gòu)建的bcr/abl特異性樹突狀細(xì)胞瘤苗。 6、bcr/abl特異性樹突狀細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)CTLs體外殺傷K562細(xì)胞在效靶比分別為40：1和20：1時(shí)，實(shí)驗(yàn)組A誘導(dǎo)的CTLs對(duì)K562細(xì)

12、胞的殺傷效率分別為47.62﹪±4.70﹪和47.50﹪±1.64﹪；實(shí)驗(yàn)組B對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效率分別為25.78﹪±4.43﹪和24.56﹪±6.30﹪；空白對(duì)照組對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效率分別為5.72﹪±1.30﹪和4.48﹪±1.62﹪。采用單因素方差分析進(jìn)行檢驗(yàn)，在任一固定效靶比下，實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B及空白對(duì)照組兩兩比較，差別均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；對(duì)實(shí)驗(yàn)組A、實(shí)驗(yàn)組B及空白對(duì)照組分別在不同效靶比下的殺傷效率作兩兩

13、比較，差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，負(fù)載了bcr/abl腫瘤抗原的DC能顯著增強(qiáng)CTLs對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用，而以重組腺病毒為載體介導(dǎo)bcr/abl基因片段轉(zhuǎn)導(dǎo)Dc制備的瘤苗又較多肽負(fù)載的DC瘤苗具有更加顯著的誘導(dǎo)CTLs殺傷慢粒白血病K562效率細(xì)胞的作用。 結(jié)論 1、克隆bcr/abl基因片段，成功構(gòu)建了pAd-bcr/abl復(fù)制缺陷型重組腺病毒表達(dá)載體。 2、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法介

14、導(dǎo)pAd-bcr/abl重組體轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝產(chǎn)生高滴度的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-bcr/abl。 3、通過(guò)聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子rhGM-CSF和rhIL-4由健康人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)出具有典型樹突狀形態(tài)特征的DC；流式細(xì)胞儀檢測(cè)表達(dá)成熟DC表面標(biāo)記及高水平的共刺激分子。 4、用轉(zhuǎn)導(dǎo)了腫瘤抗原基因的復(fù)制缺陷型重組腺病毒Ad-bcr/abl轉(zhuǎn)染DC，成功制備出bcr/abl特異性的樹突狀細(xì)胞瘤苗。 5