DON模擬表位的兩種表達載體的構建及應用研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是一種由鐮刀菌產生的霉菌毒素，由于DON對人及動物具有致畸作用、細胞毒性及免疫毒性等危害，因此其污染對人類和動物的安全構成了嚴重的威脅。
　　 目前，DON的分析檢測方法主要包括高效液相色譜法、薄層色譜法、液相-質譜聯(lián)用法等。但這些方法都耗時耗力、操作復雜。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)是一種以免疫化學為

2、基礎的檢測方法，它具有靈敏度高、檢測快速和操作簡便等特性。但是，常規(guī)ELISA檢測方法需要使用DON標準品偶聯(lián)載體蛋白制備競爭抗原，存在DON標準品購買成本高和對檢測操作人員的健康有害等缺陷。因此，尋求一種能夠代替DON進行ELISA檢測的物質顯得非常有必要。DON模擬表位（CMRPWLQ），簡稱CDON，能夠替代天然抗原與抗DON抗體相結合，且DON模擬表位具有無毒及廉價等特性。因此，DON模擬表位的高效表達給以上問題提供了一條新的解

3、決途徑。本研究構建了兩種表達載體，并以之表達了二種CDON的融合蛋白，使用ELISA方法檢測兩種融合蛋白的反應原性，建立了DON的無毒ELISA檢測方法。主要結果如下:
　　 1.將含有DON模擬表位(CMRPWLQ)及BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點的T11T12寡核苷酸雙鏈克隆至pGEX-4T-1質粒，構建出了pGEX-4T-1-CDON重組質粒。將含有DON模擬表位（CMRPWLQ）及BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點的T13T1

4、4寡核苷酸雙鏈克隆至pC89S4噬菌粒，構建出了重組噬菌粒pC89S4-CDON。
　　 2.將pGEX-4T-1-CDON轉化感受態(tài)BL21(DE3)，得到工程菌pGEX-4T-1-cdon，對誘導時間、溫度、加入IPTG時菌體濃度及IPTG的量進行了優(yōu)化。得出最優(yōu)條件為當菌體濃度達到0.6時加入IPTG至終濃度為1mM，于25℃誘導表達6h。超聲破碎菌體，利用GST-resin純化系統(tǒng)得到97％純度的融合蛋白。
　　

5、 3.將pC89S4-CDON轉化感受態(tài)XL1-Blue，得到工程菌pC89S4-cdon。通過絲狀噬菌體pⅧ展示系統(tǒng)表達出了展示有高密度DON模擬表位的重組噬菌體，對誘導時間、溫度、輔助噬菌體KM13超感染是菌體濃度、加入IPTG時菌體濃度及IPTG的量進行優(yōu)化。噬菌體展示DON模擬表位融合蛋白pⅧ-CDON的最佳條件為:當菌體濃度達到0.3時加入KM13超感染，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600達到0.6時，加入IPTG至終濃度為1mM，于25℃