兩種不同肝纖維化相關(guān)細(xì)胞因子shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、目的：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）是新近發(fā)現(xiàn)的一種促肝纖維化的重要細(xì)胞因子，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì)。CTGF可直接介導(dǎo)原代肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化、增殖及遷移，還能促進(jìn)活化HSC的合成及分泌細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）也是TGF-

2、β信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游效應(yīng)介質(zhì)，在肝纖維化發(fā)生時(shí)，它主要由激活的HSC表達(dá)。TIMP-1不僅抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）活性阻止膠原降解，也通過抑制HSC凋亡、促進(jìn)膠原分泌而在肝纖維化病情進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。所以，減少CTGF和TIMP-1的表達(dá)，可以減輕肝纖維化程度。本研究旨在構(gòu)建以大鼠CTGF或TIMP-1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）表達(dá)

3、載體，為進(jìn)一步探索肝纖維化的基因治療提供有力工具。 方法：根據(jù)前期篩選出的對(duì)CTGF和TIMP-1基因最有效的RNA干擾靶位，即CTGF基因1560～1580nt和TIMP-1基因412～432nt，按照RNA干擾（RNA interference，RNAi）序列設(shè)計(jì)原則，各設(shè)計(jì)1對(duì)含有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNAi靶點(diǎn)序列，退火形成雙鏈DNA，分別克隆到經(jīng)雙酶切后的質(zhì)粒載體psiRNA-h7SKGFPzeo，構(gòu)建成含目的靶基因片段的重組

4、質(zhì)粒載體psiRNA-GFP-CTGF和psiRNA-GFP-TIMP-1，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切瓊脂糖電泳和測(cè)序鑒定。 結(jié)果：酶切證實(shí)以大鼠CTGF或TIMP-1基因?yàn)榘悬c(diǎn)的表達(dá)shRNA的目的基因片段分別被成功的克隆到質(zhì)粒載體psiRNA-h7SKGFPzeo中，測(cè)序結(jié)果證明重組質(zhì)粒載體的插入序列與設(shè)計(jì)的靶基因片段完全一致。 結(jié)論：成功構(gòu)建靶向大鼠CTGF和TIMP-1最有效的RNA干擾靶位的shRNA表達(dá)質(zhì)粒重組體