P物質及其受體在偏頭痛大鼠中腦的變化及硫酸鎂對其變化的影響.pdf

1、目的: 偏頭痛是神經科常見的疾病，其發(fā)病機制至今尚不完全明確。隨著對神經肽的深入研究，發(fā)現多種神經肽與偏頭痛發(fā)生有關，如P物質、降鈣素基因相關肽、神經激肽A等。其中，P物質作為神經遞質在感覺信息傳遞和痛覺調制中的作用越來越多地引起人們的注意。目前的研究認為P物質對痛覺信息的傳遞可能起雙重作用：一方面作為傷害信息傳入纖維的神經遞質，在脊髓背角、三叉神經脊束核等部位對痛覺傳遞的第一級突觸起促進或易化作用；另一方面在腦內則發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，對痛覺

2、感受進行調制，降低對痛覺的敏感度。在與偏頭痛相關的腦區(qū)，如中腦導水管周圍灰質、中縫核等處存在豐富的P物質及其受體，然而，對在腦內的定量表達很少報道。實時定量PCR技術是目前國際公認的最準確、重復性最好的核酸分子定量定性檢測方法，本研究建立了大鼠P物質及其受體的實時定量PCR檢測方法，對偏頭痛大鼠中腦P物質及其受體的基因表達進行絕對定量檢測，同時應用免疫組織化學方法，檢測該部位P物質及其受體蛋白水平的表達變化，探討P物質及其受體在偏頭痛病

3、理生理過程中的變化情況。
　　 鎂是人體必需的微量元素，它可以影響眾多細胞功能，在細胞內起重要作用。臨床應用鎂劑預防、治療偏頭痛發(fā)作，取得了較為滿意的效果。目前研究推測鎂離子可能通過促進皮層擴散抑制、調節(jié)神經遞質釋放、改變腦興奮性、影響血小板功能等多種途徑參與偏頭痛病理生理過程。本研究觀察硫酸鎂干預下偏頭痛大鼠行為學、中腦P物質及其受體表達的變化。進一步證實硫酸鎂對偏頭痛的防治作用，同時探討其機制。
　　 本研究擬解決如

4、下問題：①觀察偏頭痛大鼠中腦P物質及其受體表達有何變化，進而探討P物質與偏頭痛發(fā)作的關系。②動物模型進一步證實硫酸鎂干預后偏頭痛大鼠行為學變化，并觀察其變化是否存在劑量依賴性。③明確硫酸鎂對偏頭痛的影響機制是否與中腦P物質及其受體有關。
　　 方法:
　　 1.動物分組、造模與干預：將成年健康Wistar大鼠72只按隨機數字表法分6組：對照組、偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫

5、酸鎂對照組、每組12只。對照組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠皮下注射生理鹽水2mL/kg，偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠皮下注射硝酸甘油10mg/kg，建立實驗性偏頭痛模型，以出現雙耳發(fā)紅、前肢頻繁搔頭、爬籠次數增多、咬尾、往返運動等提示模型動物頭部不適的癥狀為造模成功的指標。5min后再分別給低劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組大鼠硫酸鎂100mg/kg腹腔注射，高劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂對

6、照組大鼠硫酸鎂300mg/kg腹腔注射。
　　 2.行為學觀察：觀察偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠給予硝酸甘油后及對照組、低劑量硫酸鎂對照組，高劑量硫酸鎂對照組大鼠給予生理鹽水后60min-90min內撓頭、爬籠、咬尾、往返運動的次數總和(每個癥狀出現1次計1分)。
　　 3.實時定量PCR檢測各組大鼠中腦P物質及其受體的表達：偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠給予硝酸甘油后及對照

7、組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠給予生理鹽水后2.0h，10％水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，斷頭取腦。分離出中腦后立即置于液氮中，保存于-70℃冰箱中。取中腦組織50-100mg，根據總RNA提取試劑盒步驟操作，提取總RNA。經凝膠電泳后，使用紫外分光光度儀檢測抽提總RNA的質量和濃度。要求A260/A280比值1.9-2.0，并計算RNA濃度(RNA樣本濃度(μg/μL)=A260×稀釋倍數×40÷100

8、0)。每一標本取總RNA 300ng，進行反轉錄。合成好的cDNA置-70℃保存?zhèn)溆?。應用SP、NK1受體和NK3受體特異引物，進行PCR擴增。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，試劑盒回收?；厥占兓哪康幕蚺cpMD-18T載體連接，轉化到E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，氨芐青霉素篩選后提取質粒，重組質粒經過酶切及測序鑒定后，證實SP、NK1受體和NK3受體cDNA全長完全正確。將所提取的質粒在260nm下測OD260值，計算拷貝數，

9、用無菌水10倍系列稀釋、分裝、作為標準品，-20℃保存。將各組大鼠中腦SP、NK1受體和NK3受體cDNA與相應重組質粒同時行SYBR Green I實時定量PCR擴增，計算各組大鼠中腦SP、NK1受體和NK3受體mRNA的絕對表達量。
　　 4.免疫組織化學檢測各組大鼠中腦導水管周圍灰質P物質及其受體的分布及表達：偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠給予硝酸甘油后及對照組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組

10、大鼠給予生理鹽水后2.0h，各組大鼠用10％水合氯醛(300mg/kg)麻醉成功后，打開胸腔，暴露心臟，用小剪刀剪開右心耳，從左心室插管用生理鹽水進行灌流，之后緩慢注入10％甲醛100ml固定，斷頭取腦。將完整的鼠腦放入4％多聚甲醛中固定，常規(guī)脫水透明，低溫石蠟包埋，切片，應用SP、NK1受體、NK3受體單克隆抗體行免疫組化染色。光鏡下可見SP、XK1受體、NK3受體免疫反應陽性神經元的胞體和樹突被均勻染成棕色。于400倍光鏡下記錄滑車

11、神經核水平中腦導水管周圍灰質腹側區(qū)、背側區(qū)各3個視野，計算平均陽性細胞數。
　　 5.用SAS統(tǒng)計學軟件處理數據，各組大鼠行為學計分結果(撓頭、爬籠、咬尾、往返運動的計分總和)用均數±標準差(-x±S)表示，各組做方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。檢測出的各組SP mRNA拷貝數變異較大，結果采用均數±標準差(-x±S)表示，各組做方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。免疫組化檢測出的各組大鼠中腦導水管周圍灰質腹

12、側區(qū)、背側區(qū)SP、NK1受體、NK3受體陽性細胞數，結果采用均數±標準差(-x±S)表示，各組做方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果:
　　 1.行為學結果：低劑量硫酸鎂治療組和高劑量硫酸鎂治療組行為學改變較偏頭痛組明顯減輕(P<0.05)，而高劑量硫酸鎂治療組大鼠行為學減輕程度較低劑量硫酸鎂治療組更為明顯(P<0.05)。
　　 2.各組大鼠中腦SP、NK1受體和NK3受體基因水平表達情況：

13、偏頭痛組大鼠中腦P物質mRNA拷貝數明顯低于對照組(P<0.05)；低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦P物質mRNA拷貝數明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。高劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦NK1受體mRNA拷貝數明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。對照組、偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦NK3受

14、體mRNA拷貝數無明顯差異(P>0.05)。
　　 3.各組大鼠中腦導水管周圍灰質SP、NK1受體和NK3受體蛋白水平表達情況：高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦PAG區(qū)滑車神經核水平SP陽性細胞數明顯高于對照組(P<0.05)。低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組大鼠中腦PAG區(qū)滑車神經核水平SP陽性細胞數明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦

15、PAG區(qū)滑車神經核水平NK1受體陽性細胞數明顯高于偏頭痛組和對照組(P<0.05)。對照組、偏頭痛組、低劑量硫酸鎂治療組、高劑量硫酸鎂治療組、低劑量硫酸鎂對照組、高劑量硫酸鎂對照組大鼠中腦PAG區(qū)滑車神經核水平NK3受體陽性細胞數無明顯差異(P>0.05)。
　　 結論:
　　 1.本研究所建立的檢測大鼠P物質及其NK1受體、NK3受體mRNA的SYBRGreen I實時定量PCR方法具有敏感性高、特異性強和線性范圍廣等

16、特點，適用于對大鼠各種組織P物質及其NKi受體、NK3受體mRNA的大量樣本檢測。
　　 2.硝酸甘油10mg/kg皮下注射可以成功建立硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型。該模型行為癥狀表現(耳紅、撓頭、爬籠)與病理生化變化與人類偏頭痛發(fā)作時的表現及變化有一定的相似性，符合模型設計時應遵循的標準化、相似性、重復性、適用性、經濟性原則，且造模方法簡單、經濟，機制單一，可在短期內大量復制，是研究偏頭痛較為理想的動物模型。在今后的研究中要進一步

17、完善該模型行為學評價體系，制定統(tǒng)一定量的模型成功標準。
　　 3。偏頭痛大鼠中腦SP基因水平表達減少，而SP蛋白水平表達未見明顯變化，需進一步觀察偏頭痛不同時期SP的表達，明確SP在偏頭痛發(fā)作過程中的變化規(guī)律。
　　 4.硫酸鎂可以減輕偏頭痛大鼠行為學癥狀，并具有劑量依賴性。
　　 5.硫酸鎂治療偏頭痛的作用與促進中腦SP及NKi受體表達有關。
　　 6.硫酸鎂預防偏頭痛的作用，也可能與其增加中腦SP及N