人脂肪干細胞的分離培養(yǎng)與維生素C對其增殖機制的研究.pdf

1、目的：⑴探索一種體外高效分離、擴增、純化人脂肪干細胞(Human adipose-derivedstem cells, hADSCs)的方法，并通過形態(tài)學、多向誘導(dǎo)分化能力及免疫表型進行鑒定，從而建立一套快速、高效、穩(wěn)定的hADSCs培養(yǎng)體系。為hADSCs的后期研究提供充足的細胞來源。⑵研究維生素C(Vitamin C，Vc)對hADSCs體外增值的影響，并初步探索其相關(guān)機制。
　　 方法：①收集3例健康人的腹部皮下脂肪組織，

2、通過改進組織塊貼壁法，從脂肪組織中分離出脂肪干細胞，進行體外的擴增、純化及觀察其形態(tài)特征;通過將分離的細胞進行成脂、成骨誘導(dǎo)分化后用油紅O和Von Kossa染色定性鑒定;應(yīng)用流式細胞儀檢測所分離細胞的表面抗原。②將Vc作用hADSCs后，CCK-8細胞計數(shù)試劑盒檢測不同時間的吸光度值并繪制生長曲線;流式細胞儀檢測hADSCs細胞周期的改變和對H2O2介導(dǎo)的細胞凋亡的保護作用;間接免疫熒光和Western Blot檢測P53和Cycli

3、n D1基因表達的變化。所得數(shù)據(jù)使用SPSS17統(tǒng)計軟件分析。
　　 結(jié)果：⑴原代及傳代的hADSCs均呈長梭形或多邊形貼壁生長，生長能力旺盛。傳代后的細胞較快貼壁，迅速進入生長期，5d左右即可進行下一次傳代。隨著代數(shù)的增加，其他非ADSCs細胞逐漸減少，傳代至第3代細胞時，細胞已相對純化。⑵經(jīng)成脂和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)后，油紅O染色和Von Kossa染色陽性。⑶細胞表面抗原表達:CD44，CD105，CD29和CD13高表達。

4、相比之下，CD34，CD31和CD106幾乎沒有表達。⑷CCK-8結(jié)果顯示Vc可促進細胞增殖，且40μg/ml的濃度已有明顯的促增殖作用(P＜0.05)。⑸流式細胞儀分析結(jié)果所示，40μg/ml的Vc作用hADSCs24h后，G1期的細胞比例呈下降趨勢，S期和G2期的細胞比例呈上升趨勢，各時相與對照組比較差異均有顯著性(P＜0.01)。并且Vc能對H2O2誘導(dǎo)的hADSCs凋亡起到明顯的保護作用(P＜0.05)。⑹激光共聚焦和蛋白免疫印

5、跡結(jié)果顯示，與對照組相比，P53的蛋白表達水平降低，差異有顯著性（P＜0.05）。而Cyclin D1的蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01）。
　　 結(jié)論：①建立了一種相對成熟的hADSCs的體外培養(yǎng)方法，細胞增殖迅速，狀態(tài)良好，生物學性質(zhì)穩(wěn)定，無過多的非ADSCs的干擾;綜合細胞形態(tài)、細胞表面抗原標志鑒定及成脂誘導(dǎo)和成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)的結(jié)果可以確定培養(yǎng)細胞為hADSCs。②Vc對hADSCs的增殖作用與Vc的濃度有關(guān)，40μ/ml的