赭曲霉素A誘導(dǎo)BHK細(xì)胞凋亡及維生素C對其毒性干預(yù)的研究.pdf

1、赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是由青霉菌屬和曲霉菌屬產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似的有毒代謝產(chǎn)物之一。OTA具有強(qiáng)腎毒性和肝毒性，可導(dǎo)致巴爾干腎病，并有致畸、致突變和致癌作用。OTA在世界范圍內(nèi)污染谷物和大豆等飼料及食品，其廣泛污染性和強(qiáng)毒性極大的影響了人類和動物的健康。在目前已知的真菌毒素家族中，根據(jù)其重要性及危害性排序，OTA位列第二僅次于黃曲霉毒素。OTA具有器官毒性、免疫毒性、細(xì)胞毒性、基因毒性，神經(jīng)毒性等，目前OTA誘導(dǎo)細(xì)

2、胞凋亡的機(jī)制仍不清楚，通過添加抗氧化物質(zhì)干預(yù)OTA對細(xì)胞毒性作用的研究更少。本試驗選用OTA的敏感細(xì)胞BHK作為研究對象，研究在不同濃度梯度OTA作用下，觀察BHK細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;檢測OTA誘導(dǎo)BHK細(xì)胞凋亡途徑中可能的關(guān)鍵凋亡蛋白Caspase-3，p53，Bax蛋白的表達(dá)情況來探討OTA誘導(dǎo)BHK細(xì)胞凋亡的機(jī)制，為深入研究OTA腎毒性的毒理機(jī)制打下基礎(chǔ)。通過檢測乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDH）的釋放，

3、細(xì)胞增殖抑制率，超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD)的活性等，探討不同濃度梯度維生素C(VitaminC，VC)對不同濃度梯度的OTA作用BHK細(xì)胞的影響，為深入研究VC對OTA細(xì)胞毒性的干預(yù)提供依據(jù)。
　　 試驗Ⅰ:OTA誘導(dǎo)BHK細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化
　　 本試驗將處于對數(shù)生長期的BHK細(xì)胞以不同濃度的OTA進(jìn)行處理，并設(shè)置空白對照組。24h后采用MTT法測定各濃度組毒素對BHK細(xì)胞的毒性

4、作用;于倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察BHK細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化（采用AO-EB染色法），并計數(shù)正常細(xì)胞，凋亡細(xì)胞，計算凋亡率。結(jié)果顯示:隨著OTA濃度的加大，細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增大，IC50為32μg·mL-1。隨著OTA濃度的增加，BHK細(xì)胞數(shù)量減少，且部分細(xì)胞由梭形變成圓形，說明OTA抑制BHK細(xì)胞生長。熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞的核被染成橘紅色，染色質(zhì)高度濃縮或片段化，核外周形成“新月狀”，某些細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體。當(dāng)OTA濃度在2.5～

5、20μg·mL-1范圍，凋亡率隨OTA濃度的增加而升高;而當(dāng)OTA濃度大于20μg·mL-1時，凋亡率反而下降。
　　 試驗Ⅱ:OTA誘導(dǎo)BHK細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究
　　 本試驗將處于對數(shù)生長期的BHK細(xì)胞以不同濃度OTA進(jìn)行處理，并設(shè)置空白對照組。24h后采用SDS-PAGE膠分離蛋白，Westernblotting記錄Caspase-3，p53，Bax蛋白及內(nèi)參蛋白β-actin的表達(dá)情況，使用Quantityone軟

6、件進(jìn)行定量。結(jié)果顯示:在2.5～10μg·mL-1范圍內(nèi)隨著OTA濃度的升高，Caspase-3，p53，Bax蛋白的表達(dá)量均增加，且在10μg·mL-1時達(dá)到峰值。在20～40μg·mL-1范圍內(nèi)隨著OTA濃度的升高，三者表達(dá)量下降，但均高于空白對照。其中當(dāng)OTA濃度為5、10、20μg·mL-1時，Caspase-3相對表達(dá)量與對照組差異極顯著(P＜0.01);當(dāng)OTA濃度為5、10μg·mL-1時，p53相對表達(dá)量與對照組差異極顯

7、著(P＜0.01);當(dāng)OTA濃度為5、10、40μg·mL-1時，Bax蛋白相對表達(dá)量與對照組差異極顯著(P＜0.01)。三者表達(dá)量的變化呈現(xiàn)正相關(guān)，因此關(guān)鍵凋亡蛋白的活化說明OTA誘導(dǎo)BHK細(xì)胞的凋亡途徑很可能是線粒體途徑。
　　 試驗Ⅲ:維生素C對OTA細(xì)胞毒性的干預(yù)作用
　　 本試驗將處于對數(shù)生長期的BHK細(xì)胞以不同濃度的VC進(jìn)行預(yù)處理，并設(shè)置空白對照組。添加不同濃度的OTA處理24h后，MTT法檢測細(xì)胞毒性變化，

8、光學(xué)顯微鏡觀察形態(tài)學(xué)變化，試劑盒檢測乳酸脫氫酶的釋放及SOD的活性。結(jié)果顯示:當(dāng)VC濃度≤50μmol·L-1時，對BHK細(xì)胞的增殖基本沒有抑制，當(dāng)VC濃度增加至100～200μmol·L-1時，細(xì)胞的增殖抑制率增加，但均低于10％。光學(xué)顯微鏡下，除200μmol·L-1外，其他濃度的VC對BHK細(xì)胞形態(tài)并無影響。當(dāng)VC濃度≤50μmol·L-1、OTA濃度≤40μg·mL-1時，隨著VC濃度的增加，細(xì)胞的增殖抑制率下降;當(dāng)VC濃度為1

9、00～200μmol·L-1、OTA濃度≤10μg·mL-1時，BHK細(xì)胞的增殖抑制率均高于各組的空白對照。當(dāng)OTA濃度≤20μg·mL-1、VC濃度≤200μmol·L-1時，乳酸脫氫酶釋放較低;而OTA濃度為40μg·mL-1時，乳酸脫氫酶釋放較高。當(dāng)OTA濃度≤20μg·mL-1、VC濃度≤100μmol·L-1時，SOD的活性升高;當(dāng)VC濃度為200μmol·L-1、OTA濃度為40μg·mL-1時，SOD活性下降至最低?？傊?，