聯(lián)合轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549細(xì)胞生長的研究.pdf

1、目的：本實驗針對Survivin和VEGF mRNA序列設(shè)計反義寡核苷酸（ASODN），以脂質(zhì)體（Lip）為載體，應(yīng)用Survivin和VEGF ASODN聯(lián)合轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株，探討同時抑制Survivin和VEGF兩個基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖、凋亡以及基因表達(dá)的影響，為非小細(xì)胞肺癌雙靶點基因治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：①將實驗分為7組，Blank組：A549細(xì)胞；Lip組：Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染A549

2、細(xì)胞；Survivin SODN組；VEGF SODN組；Survivin ASODN；VEGF ASODN；Survivin+VEGF組：Survivin ASODN和VEGF ASODN聯(lián)合轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。②利用反義寡核苷酸技術(shù)，以脂質(zhì)體（Lip）為載體，分別介導(dǎo)200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN單獨轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，鏡下觀察轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞形態(tài)變化，轉(zhuǎn)染

3、24h、48h、72h、96h后，MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率，RT-PCR測定細(xì)胞中Survivin和VEGF基因mRNA表達(dá)。③用脂質(zhì)體介導(dǎo)400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN聯(lián)合轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，48h后觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染組細(xì)胞形態(tài)變化，MTT檢測細(xì)胞增殖情況，RT-PCR檢測Survivin和VEGF mRNA表達(dá)，流式細(xì)胞儀（FCM）檢測細(xì)胞凋亡和Survivin蛋白表達(dá)。
　

4、　結(jié)果：①顯微鏡下Blank組、Lip組、SODN組細(xì)胞形態(tài)完整、貼壁良好，ASODN組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則、生長減慢，Survivin+VEGF組細(xì)胞皺縮、成簇狀漂?。虎?MTT結(jié)果顯示A549細(xì)胞分別經(jīng)200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN轉(zhuǎn)染，孵育24h，48h，72h，96h后細(xì)胞生長出現(xiàn)不同程度的抑制，與Blank組、Lip組、SODN組相比，細(xì)胞增殖抑制率

5、顯著升高（P<0.05）；且Survivin ASODN和VEGF ASODN抑制作用均在48h達(dá)到高峰，隨孵育時間增加，抑制作用逐漸減弱；③ ASODN組抑制作用呈劑量依賴性，其中Survivin ASODN在400nmol/L濃度處出現(xiàn)明顯的抑制效果，細(xì)胞增殖抑制率為（49.24±1.15）%，與200nmol/L（39.54±1.93）%相比顯著增高（P<0.05），mRNA相對含量明顯降低（P<0.05）；VEGF ASODN在

6、10μmol/L濃度處出現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)，抑制率為（39.54±1.44）%，抑制作用比濃度為5μmol/L（27.47±1.30）%時明顯增強，mRNA表達(dá)也顯著降低，兩者差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；④400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞48h后， Survivin+VEGF組的細(xì)胞生長抑制率為（61.37±1.94）%，較單獨轉(zhuǎn)染 Survivin AS

7、ODN（50.44±1.13）%和 VEGF ASODN（39.33±1.99）%的抑制效果明顯增加(P＜0.05)；⑤ Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測Survivin+VEGF組 A549細(xì)胞凋亡率為（57.03±1.61）%，顯著高于Survivin ASODN（22.33±2.41）%和VEGF ASODN（18.28±1.13）%單獨轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；⑥ RT-PCR結(jié)果顯

8、示 Survivin+VEGF組 Survivin mRNA和VEGF mRNA相對含量分別為（15.26±1.31）%和（13.12±1.45）%，較Blank組、Lip組、SODN組、ASODN組顯著降低（P<0.01），ASODN組中單個基因被抑制，另一基因 mRNA表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)；⑦流式檢測 Survivin蛋白表達(dá)率， Survivin+VEGF組為（30.40±1.33）%、Survivin ASODN組為（41.41±1.

9、19）%、VEGF ASODN組為（46.84±1.72）%，雙基因ASODN聯(lián)合轉(zhuǎn)染對Survivin蛋白表達(dá)的抑制強度明顯高于單獨轉(zhuǎn)染組（P<0.05），此外，Survivin蛋白的表達(dá)在VEGF ASODN組也明顯減少（P<0.05）。
　　結(jié)論：Survivin和VEGF ASODN聯(lián)合轉(zhuǎn)染能夠抑制A549細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡，同時顯著降低Survivin和VEGF mRNA以及Survivin蛋白的表達(dá)，兩基因反義寡核