聯合轉染反義寡核苷酸Survivin和VEGF抑制肺癌A549細胞生長的研究.pdf

1、目的：本實驗針對Survivin和VEGF mRNA序列設計反義寡核苷酸（ASODN），以脂質體（Lip）為載體，應用Survivin和VEGF ASODN聯合轉染非小細胞肺癌A549細胞株，探討同時抑制Survivin和VEGF兩個基因對肺癌細胞增殖、凋亡以及基因表達的影響，為非小細胞肺癌雙靶點基因治療提供實驗依據。
　　方法：①將實驗分為7組，Blank組：A549細胞；Lip組：Lipofectamine2000轉染A549

2、細胞；Survivin SODN組；VEGF SODN組；Survivin ASODN；VEGF ASODN；Survivin+VEGF組：Survivin ASODN和VEGF ASODN聯合轉染A549細胞。②利用反義寡核苷酸技術，以脂質體（Lip）為載體，分別介導200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN單獨轉染A549細胞，鏡下觀察轉染后的細胞形態(tài)變化，轉染

3、24h、48h、72h、96h后，MTT法檢測細胞生長抑制率，RT-PCR測定細胞中Survivin和VEGF基因mRNA表達。③用脂質體介導400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN聯合轉染A549細胞，48h后觀察聯合轉染組細胞形態(tài)變化，MTT檢測細胞增殖情況，RT-PCR檢測Survivin和VEGF mRNA表達，流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡和Survivin蛋白表達。
　

4、　結果：①顯微鏡下Blank組、Lip組、SODN組細胞形態(tài)完整、貼壁良好，ASODN組細胞形態(tài)不規(guī)則、生長減慢，Survivin+VEGF組細胞皺縮、成簇狀漂??；② MTT結果顯示A549細胞分別經200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN轉染，孵育24h，48h，72h，96h后細胞生長出現不同程度的抑制，與Blank組、Lip組、SODN組相比，細胞增殖抑制率

5、顯著升高（P<0.05）；且Survivin ASODN和VEGF ASODN抑制作用均在48h達到高峰，隨孵育時間增加，抑制作用逐漸減弱；③ ASODN組抑制作用呈劑量依賴性，其中Survivin ASODN在400nmol/L濃度處出現明顯的抑制效果，細胞增殖抑制率為（49.24±1.15）%，與200nmol/L（39.54±1.93）%相比顯著增高（P<0.05），mRNA相對含量明顯降低（P<0.05）；VEGF ASODN在

6、10μmol/L濃度處出現明顯的抑制效應，抑制率為（39.54±1.44）%，抑制作用比濃度為5μmol/L（27.47±1.30）%時明顯增強，mRNA表達也顯著降低，兩者差異均具有統計學意義（P<0.05）；④400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN轉染 A549細胞48h后， Survivin+VEGF組的細胞生長抑制率為（61.37±1.94）%，較單獨轉染 Survivin AS

7、ODN（50.44±1.13）%和 VEGF ASODN（39.33±1.99）%的抑制效果明顯增加(P＜0.05)；⑤ Annexin V-FITC/PI雙標記細胞后流式細胞儀檢測Survivin+VEGF組 A549細胞凋亡率為（57.03±1.61）%，顯著高于Survivin ASODN（22.33±2.41）%和VEGF ASODN（18.28±1.13）%單獨轉染組，差異具有統計學意義(P＜0.05)；⑥ RT-PCR結果顯

8、示 Survivin+VEGF組 Survivin mRNA和VEGF mRNA相對含量分別為（15.26±1.31）%和（13.12±1.45）%，較Blank組、Lip組、SODN組、ASODN組顯著降低（P<0.01），ASODN組中單個基因被抑制，另一基因 mRNA表達也出現下調；⑦流式檢測 Survivin蛋白表達率， Survivin+VEGF組為（30.40±1.33）%、Survivin ASODN組為（41.41±1.

9、19）%、VEGF ASODN組為（46.84±1.72）%，雙基因ASODN聯合轉染對Survivin蛋白表達的抑制強度明顯高于單獨轉染組（P<0.05），此外，Survivin蛋白的表達在VEGF ASODN組也明顯減少（P<0.05）。
　　結論：Survivin和VEGF ASODN聯合轉染能夠抑制A549細胞增殖，促進細胞凋亡，同時顯著降低Survivin和VEGF mRNA以及Survivin蛋白的表達，兩基因反義寡核