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文檔簡介
1、目的:本實驗針對Survivin和VEGF mRNA序列設計反義寡核苷酸(ASODN),以脂質體(Lip)為載體,應用Survivin和VEGF ASODN聯合轉染非小細胞肺癌A549細胞株,探討同時抑制Survivin和VEGF兩個基因對肺癌細胞增殖、凋亡以及基因表達的影響,為非小細胞肺癌雙靶點基因治療提供實驗依據。
方法:①將實驗分為7組,Blank組:A549細胞;Lip組:Lipofectamine2000轉染A549
2、細胞;Survivin SODN組;VEGF SODN組;Survivin ASODN;VEGF ASODN;Survivin+VEGF組:Survivin ASODN和VEGF ASODN聯合轉染A549細胞。②利用反義寡核苷酸技術,以脂質體(Lip)為載體,分別介導200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN單獨轉染A549細胞,鏡下觀察轉染后的細胞形態(tài)變化,轉染
3、24h、48h、72h、96h后,MTT法檢測細胞生長抑制率,RT-PCR測定細胞中Survivin和VEGF基因mRNA表達。③用脂質體介導400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN聯合轉染A549細胞,48h后觀察聯合轉染組細胞形態(tài)變化,MTT檢測細胞增殖情況,RT-PCR檢測Survivin和VEGF mRNA表達,流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡和Survivin蛋白表達。
4、 結果:①顯微鏡下Blank組、Lip組、SODN組細胞形態(tài)完整、貼壁良好,ASODN組細胞形態(tài)不規(guī)則、生長減慢,Survivin+VEGF組細胞皺縮、成簇狀漂??;② MTT結果顯示A549細胞分別經200、400、600nmol/L Survivin ASODN和5、10、20μmol/L VEGF ASODN轉染,孵育24h,48h,72h,96h后細胞生長出現不同程度的抑制,與Blank組、Lip組、SODN組相比,細胞增殖抑制率
5、顯著升高(P<0.05);且Survivin ASODN和VEGF ASODN抑制作用均在48h達到高峰,隨孵育時間增加,抑制作用逐漸減弱;③ ASODN組抑制作用呈劑量依賴性,其中Survivin ASODN在400nmol/L濃度處出現明顯的抑制效果,細胞增殖抑制率為(49.24±1.15)%,與200nmol/L(39.54±1.93)%相比顯著增高(P<0.05),mRNA相對含量明顯降低(P<0.05);VEGF ASODN在
6、10μmol/L濃度處出現明顯的抑制效應,抑制率為(39.54±1.44)%,抑制作用比濃度為5μmol/L(27.47±1.30)%時明顯增強,mRNA表達也顯著降低,兩者差異均具有統計學意義(P<0.05);④400nmol/L Survivin ASODN和10μmol/L VEGF ASODN轉染 A549細胞48h后, Survivin+VEGF組的細胞生長抑制率為(61.37±1.94)%,較單獨轉染 Survivin AS
7、ODN(50.44±1.13)%和 VEGF ASODN(39.33±1.99)%的抑制效果明顯增加(P<0.05);⑤ Annexin V-FITC/PI雙標記細胞后流式細胞儀檢測Survivin+VEGF組 A549細胞凋亡率為(57.03±1.61)%,顯著高于Survivin ASODN(22.33±2.41)%和VEGF ASODN(18.28±1.13)%單獨轉染組,差異具有統計學意義(P<0.05);⑥ RT-PCR結果顯
8、示 Survivin+VEGF組 Survivin mRNA和VEGF mRNA相對含量分別為(15.26±1.31)%和(13.12±1.45)%,較Blank組、Lip組、SODN組、ASODN組顯著降低(P<0.01),ASODN組中單個基因被抑制,另一基因 mRNA表達也出現下調;⑦流式檢測 Survivin蛋白表達率, Survivin+VEGF組為(30.40±1.33)%、Survivin ASODN組為(41.41±1.
9、19)%、VEGF ASODN組為(46.84±1.72)%,雙基因ASODN聯合轉染對Survivin蛋白表達的抑制強度明顯高于單獨轉染組(P<0.05),此外,Survivin蛋白的表達在VEGF ASODN組也明顯減少(P<0.05)。
結論:Survivin和VEGF ASODN聯合轉染能夠抑制A549細胞增殖,促進細胞凋亡,同時顯著降低Survivin和VEGF mRNA以及Survivin蛋白的表達,兩基因反義寡核
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