靶向Survivin的抗腫瘤反義寡核苷酸先導結構的篩選.pdf

1、中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所碩士學位論文靶向Survivin的抗腫瘤反義寡核苷酸先導結構的篩選姓名：王丹申請學位級別：碩士專業(yè)：生物化學與分子生物學指導教師：王升啟20040601靶向Survivln的抗腫瘤反義寡核苷酸先導結構的篩選中文摘要中文摘要靶向sunrivin的抗腫瘤反義寡核苷酸先導結構的篩選SⅧ吖iv證是一個新發(fā)現的凋亡抑制基因，被認為是潛在的藥物作用靶標。本研究旨在通過全長基因尋靶技術(FullIeng血ge

2、netargcting，FLGT)篩選靶向suⅣivin的抗腫瘤反義寡核苷酸并予以驗證，同時為全長基因尋靶技術提供佐證。首先，克隆靶基因sun，ivm的全長序列，體外轉錄出大量的靶mRNA；將人工合成的隨機寡核苷酸庫與靶血斟A在進行雜交，通過從雜交液中提取mRNA使與之有結合活性的反義寡核苷酸得到分離；將這些結合序列擴增、克隆并測序，測序結果與mRNA序列比對發(fā)現了15個反義結合位點；合成15個反義結合位點(A115)的寡核苷酸探針，制

3、備芯片；同位素標記的靶mRNA與芯片雜交，15個位點中的12個有不同強度的雜交信號；進一步用同位素標記的靶mRNA與芯片雜交后RNaseH原位切割，觀察其切割活性，發(fā)現雜交信號較強的探針A3半數切割時間(Tl，2)也最長，是酶切速度最慢的一個點。合成靶向上述15個位點的硫代反義寡核苷酸，處理肺癌細胞A549，MTT法檢測細胞增殖抑制率。結果表明，3個在芯片上沒有信號的反義寡核苷酸在細胞水平也沒有顯著的抑制效果，而其它12條反義寡核苷酸的

4、O8州給藥抑制率均達到70％以上。其中A3雖然與靶InRNA具有很強的結合活性，但是抑制率并不是很高，酶切速度慢可能是原因。結果表明，全長基因尋靶技術經原位雜交校正后與細胞學實驗之間有良好的相關性。進一步通過RTPCR和WjstemBlot分別驗證反義寡核苷酸對靶基因“礬A和蛋白表達水平的影響。其中4條反義寡核苷酸可明顯抑制靶基因mRNA的表達，這4條中有2條可顯著抑制靶基因蛋白的表達。綜上，通過全長基因尋靶可以較全較準的找到靶r出mA