Survivin反義寡核苷酸對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞中Survivin基因表達(dá)的影響.pdf

1、背景：肝細(xì)胞癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，惡性程度高、侵襲力強(qiáng)、預(yù)后差、病死率高。因此研究肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)理以及探討新的可行的治療方案具有極其重要的臨床意義。近年來關(guān)于肝細(xì)胞癌的治療方案日趨完善，其中反義核酸技術(shù)作為一項(xiàng)新的基因治療方式和途徑受到人們的廣泛關(guān)注。反義核酸技術(shù)的主要作用機(jī)制是反義核酸能與mRNA結(jié)合，抑制mRNA的翻譯，從而特異性地封閉靶基因，進(jìn)而影響和調(diào)節(jié)

2、靶基因的表達(dá)。 生存素(survivin)是近年來發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisproteins，IAP)家族的新成員?？勺钄嗉?xì)胞的凋亡，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。survivin僅特異性地表達(dá)于多數(shù)惡性腫瘤組織中，而在相應(yīng)正常成人組織中幾乎不表達(dá)，這種選擇性表達(dá)特性使其成為目前惡性腫瘤診斷和治療的新靶點(diǎn)。 目的：本研究通過利用反義核酸技術(shù)原理，設(shè)計(jì)合成survivin反義寡核

3、苷酸(survivinASODN)，并將其轉(zhuǎn)染于肝細(xì)胞癌SMMC-7721細(xì)胞，檢測survivin基因蛋白的表達(dá)情況，探討利用反義核酸技術(shù)將survivinASODN轉(zhuǎn)染于SMMC-7721細(xì)胞中對(duì)survivin基因及蛋白表達(dá)的影響，進(jìn)而為肝細(xì)胞癌的基因治療開辟新的途徑，并為之提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：1設(shè)計(jì)合成特異性survivinASODN及相應(yīng)的正義對(duì)照寡核苷酸(survivinSODN)，應(yīng)用Oligofect

4、amineTMReagent脂質(zhì)體介導(dǎo)，以高表達(dá)survivin基因的SMMC-7721細(xì)胞為靶細(xì)胞，將不同濃度的反義寡核苷酸及正義寡核苷酸作為阻斷劑對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，48h后收集細(xì)胞。 2提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測轉(zhuǎn)染后各不同濃度轉(zhuǎn)染組及各對(duì)照組中survivinmRNA表達(dá)的變化。以β-actin作為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物通過凝膠掃描儀進(jìn)行DNA電泳條帶的光量子強(qiáng)度分析，將surviv

5、in與β-actin比值作為survivinmRNA表達(dá)水平的參數(shù)，對(duì)survivin產(chǎn)物相對(duì)定量。 3采用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)(FCM)，檢測不同濃度的survivinASODN對(duì)SMMC-7721紐胞中survivin蛋白表達(dá)的影響。 結(jié)果：1倒置熒光顯微鏡下可見，以O(shè)ligofectamineTMReagent為載體的不同濃度各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)均見到清晰的綠色熒光，轉(zhuǎn)染效率均達(dá)到80％，并且隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加而增加，其中10

6、00nmol/L反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80～90％，而在各對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)未見到綠色熒光。 2在SMMC-7721細(xì)胞中survivinmRNA表達(dá)變化的研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各不同濃度轉(zhuǎn)染組150nmol/L、500nmol/L和1000nmol/LASODN轉(zhuǎn)染組、1000nmol/LSODN轉(zhuǎn)染組、空脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組吸光度比值分別為：3.21±0.08，1.42±0.00，0.75±0.01，3.50±0.05，3.5

7、1±0.02和3.47±0.02。其中各ASODN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞survivinmRNA表達(dá)量均低于各對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，并且隨著ASODN轉(zhuǎn)染濃度增加而明顯減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。而正義對(duì)照組、空脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組之間相互比較，SMMC-7721細(xì)胞中的survivinmRNA表達(dá)量差異無顯著性(P＞0.05)。 3survivin寡核苷酸作用于SMMC-7721細(xì)胞后，ASODN150nmol/L、500nm

8、ol/L和1000nmol/L轉(zhuǎn)染組、1000nmol/LSODN轉(zhuǎn)染組、空脂質(zhì)體組及空白對(duì)照組survivin蛋白FI值分別為：0.90±0.02，0.80±0.03，0.45±0.08，1.19±0.04，1.15±0.04和1.20±0.00。各survivinASODN轉(zhuǎn)染組中survivin蛋白表達(dá)量均低于各對(duì)照組，且差異有顯著性(P＜0.05)，并且蛋白水平的表達(dá)量隨ASODN轉(zhuǎn)染濃度增加而明顯減少，呈現(xiàn)劑量依賴性。而正義對(duì)